Thermo Fisher Scientific VetMAX Ruminant Abortion Screening Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit
PCR temps réel TaqMan® pour la détection multiplex des 8 majeurs pathogènes responsables des
avortements chez les ruminants (Coxiella burnetii, Chlamydophila spp., Listeria monocytogenes,
Salmonella spp., Campylobacter fetus, Leptospira pathogènes, Anaplasma phagocytophila et Bovine
Herpes Virus type 4)
Référence Catalogue SARP
Partie Nº 100020440 Pub. Nº MAN0008871 Rév. B.0
Technique
PCR temps réel (ADN)
– 2 Duplex et 6 Simplex
– IPC endogène
Espèce(s)
Acides nucléiques isolés à partir des matrices
Test
Ruminants
Ecouvillons placentaires, vaginaux et cervicaux
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des
gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit
disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Informations sur le produit
Description du produit
Applied Biosystems™ VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection des
principaux agents responsables d’avortements chez les ruminants (Coxiella burnetii, Chlamydophila spp., Listeria monocytogenes,
Salmonella spp., Campylobacter fetus, et Leptospira pathogènes, Anaplasma phagocytophila et Bovine Herpes Virus type 4) par la méthode de
PCR en temps réel.
Chaque échantillon d’ADN obtenu après extraction est analysé dans 8 puits indépendants : chaque puits est utilisé pour la détection
spécifique de l’ADN du pathogène d’intérêt et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit à la
fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.
Il est utilisable sur ADN extraits à partir d’écouvillons placentaires, vaginaux et cervicaux.
Les protocoles complets d’extractions des ADN à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.
Réactifs du kit et conservation
Le VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la
détection en duplex des 8 pathogènes et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre
−30°C et −10°C. Après première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :
Article
3 - Mix SAR Cox b.
(Tube rouge)
3 - Mix SAR Chlam
(Tube orange)
Description
2 Mix pour PCR TaqMan®. Contiennent :
• Le système de détection pour le pathogène cible,
comprenant une sonde TaqMan® marquée FAM™ – NFQ
(Non-Fluorescent Quencher) ou FAM™ – TAMRA™.
• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde
TaqMan® marquée VIC™ – TAMRA™.
• Le tampon et l’enzyme de PCR temps réel.
3 - Mix SAR ANAP
(Tube jaune)
3 - Mix SAR BHV4
(Tube vert)
3 - Mix SAR C. fetus
(Tube bleu)
3 - Mix SAR Lepto
(Tube violet)
3 - Mix SAR Listeria
(Tube blanc)
3 - Mix SAR Salmo
(Tube noir)
6 Mix pour PCR TaqMan®. Contiennent :
• Le système de détection pour le pathogène cible,
comprenant une sonde TaqMan® marquée FAM™ – NFQ
(Non-Fluorescent Quencher).
• Le tampon et l’enzyme de PCR temps réel.
4a - EPC SARP
(Tube marron)
External Positive Control :
Contrôle positif pour les 8 pathogènes. Il s’agit d’acides
nucléiques déjà extraits à amplifier lors de la PCR temps réel.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Volume
(25 réactions)
Conservation
Après première
A réception
utilisation
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
360 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
Témoins d’extraction et d’amplification
Le VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ADN:
4a - EPC SARP : contrôle positif en pathogènes cibles
Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la PCR temps réel.
Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification du pathogène cible par PCR temps réel.
La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal
Positive Control), présent dans chaque échantillon.
Un résultat IPC positif avec une valeur conforme dans un échantillon permet de valider l’extraction de cet échantillon qu’il soit positif
ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.
Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :
NCS : contrôle négatif d’extraction
C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé
par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les
échantillons : extraction des acides nucléiques puis PCR temps réel.
Un résultat négatif en pathogène cible et en IPC endogène permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de
la PCR temps réel.
NC : contrôle négatif d’amplification
Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau
DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.
Un résultat négatif pour le pathogène cible et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des
réactions pour la PCR temps réel.
Matériel et réactifs requis pour la PCR temps réel non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
•
Eau DNase/RNase-free
•
Tampon TE 1X
•
Tampon PBS 1X
•
Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :
•
- FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)
- VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)
Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits), microtubes
ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture
Procédure d’analyse
Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :
• 3 - Mix SAR pathogène : 20 µL par analyse
•
ADN extrait : 5 µL par analyse et par mix
Extraction des ADN
Il est nécessaire d’isoler les ADN à partir des échantillons pour l’analyse par PCR temps réel.
NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit, merci
de contacter le Support Technique.
Préparation de la PCR temps réel
1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres
échantillons.
2. Pour chaque mix utilisé pour l’analyse :
a. Décongeler le tube 3 - Mix SAR pathogène entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.
b. Homogénéiser le tube 3 - Mix SAR pathogène par agitation douce, puis centrifuger brièvement.
c. Distribuer 20 µL de 3 - Mix SAR pathogène par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.
2
VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit Notice d’Utilisation
3. Ajouter les ADN des échantillons et contrôles à chaque mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :
Type d’analyse
Echantillon pour analyse
Composant
Volume d’échantillon
ADN extraits de l’échantillon
5 µL
4a - EPC SARP
5 µL
NCS extrait
5 µL
Eau DNase/RNase-free
5 µL
Contrôle positif d’amplification
Contrôle négatif d’extraction (NCS)
Contrôle négatif d’amplification (NC)
4. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.
Amplification par PCR en temps réel
1. Créer les 9 détecteurs suivants sur le thermocycleur :
Reporter
Quencher
COXB
FAM
TAMRA™(1)
CHL, LIST, SALM, CF, ANAP, BHV4, LEPT
FAM™
NFQ (Non-Fluorescent Quencher)
IPC SARP
VIC
TAMRA™(1)
™
™
Référence passive : ROX™(1)
(1)
Les fluorophores TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.
Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.
2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur du pathogène correspondant et si le mix détecte un IPC, le détecteur IPC SAR dans
le puits utilisé pour l’analyse.
3. Créer le programme de PCR temps réel suivant pour l’analyse :
(1)
Répétitions de l’étape
Température
Durée
Etape 1
×1
50°C
2 minutes
Etape 2
×1
95°C
10 minutes
Etape 3
×45
95°C
15 secondes
60°C(1)
1 minute
Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.
4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.
Analyse des résultats
Analyse des données brutes
Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.
1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la PCR temps réel.
2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les recommandations
ci-après.
Validation du test
La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :
Détecteur Pathogène
Détecteur IPC SAR
(pour les mix détectant l’IPC)
Validation
Ct = Ct QC SAR de 4a- EPC SARP ±3Ct(1)
Ct < 45 ou Ct > 45(2)
PCR validée
NCS
Ct > 45
Ct > 45
Extraction validée
NC
Ct > 45
Ct > 45
Réactifs PCR validés
EPC SARP
(1)
(2)
Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.
Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.
Interprétation des résultats
Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous. Pour les mix ne détectant pas d’IPC, se référer à la
valeur de Ct IPC obtenue avec les mix détectant l’IPC.
(1)
Détecteur Pathogène
Détecteur IPC SARP
Interprétation
Ct < 45
Ct < 45 ou Ct > 45
Pathogène cible détecté
Ct > 45
Ct < 45
Pathogène cible non détecté
Ct > 45
Ct > 45
Non validé(1)
L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.
VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit Notice d’Utilisation
3
Conduite à tenir pour les échantillons non validés
1. Diluer l’ADN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.
2. Faire une nouvelle analyse PCR sur 5 µL de cette dilution.
3. Si l’ADN dilué est positif en pathogène cible ou négatif en pathogène cible avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors
validé.
4. Si l’ADN dilué est négatif en pathogène cible avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans ce
cas, renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.
5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Garantie produit limitée
Support technique : rendez-vous sur
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technique, notamment :
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• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également
appelées FS (Fiches Signalétiques))
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produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/
global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous
pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web
suivante : thermofisher.com/support.
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux
produits chimiques d'autres fabricants, contacter
chaque fabricant.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France
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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008871 (français)
Révision
Date
Description
B.0
22 juillet 2019
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
A.0
25 novembre 2013
Base de référence pour l’historique de révision
Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de
diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.
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22 juillet 2019