BOVIGAM™ TB Kit NOTICE D’UTILISATION Mode opératoire simplifié pour son utilisation en France selon les recommandations du laboratoire contrôle Référence catalogue 63326 Numéro de publication MAN0030314 Révision A Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Historique des révisions : MAN0030314 A Révision Date Description A 14 février 2025 Création du MAN030314 basé sur le document "Mode opératoire simplifié du Bovigam TB kit du 26 Octobre 2023, révision D.0". Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences: Ce produit peut être couvert par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ce produit, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. Garantie limitée du produit: Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. MARQUES COMMERCIALES: Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. ©2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Validé et certifié par le WOAH comme étant adapté aux fins définies dans la notice fournie dans kit. Numéro d'enregistrement : 20150110. Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France Applied Biosystems™ BOVIGAM™ TB Kit est un test sanguin rapide in vitro basé sur la détection de la réponse immunitaire à médiation cellulaire suite à une infection due à Mycobacterium bovis (ou M. caprae ou M. tuberculosis) pour le diagnostic de la tuberculose chez les bovins. A – Contenu et stockage du BOVIGAM™ TB Kit – Réf.: 63326 Conserver le kit Applied Biosystems™ BOVIGAM™ TB à une température comprise entre 2 et 8 °C Laisser tous les réactifs (sauf le conjugué - concentré 100x) à température ambiante (22±3 °C) avant leur utilisation, puis les reconserver à 2-8 °C immédiatement après utilisation. Composant Format 30 plaques Description 1- Plaque sensibilisée avec l’anticorps IFN-γ bovins 30x96 plaques avec couvercle Prêt à emploi 2- Contrôle positif IFN-γ bovins 3x 2mL Contient 0.01% p/v de thimérosal. Lyophilisé. A reconstituer avec de l'eau déionisée ou distillée. 3- Contrôle négatif IFN-γ bovins 3x2mL Contient 0.01% p/v de thimérosal. Lyophilisé. A reconstituer avec de l'eau déionisée ou distillée. 4- Diluent « Green » 1x175mL Contient 0,01 % p/v de thimérosal. Prêt à l'emploi. 5- Tampon de lavage (20X) 2x500mL Contient 0,01 % p/v de thimérosal. A diluer avec de l'eau déionisée ou distillée. 2x2mL Contient 0.01% p/v de thimérosal. Lyophilisé. A reconstituer avec de l'eau déionisée ou distillée. 2x 175mL Contient 0,01 % p/v de thimérosal. A diluer avec de l'eau déionisée ou distillée. 2x175mL Contient de l’eau. Prêt à l'emploi. 2x2mL Contient du TMB dans du DMSO. A diluer avec le tampon de substrat enzymatique 1x175mL Prêt à emploi « Positive Bovine IFN-γ Control » « Negaitive Bovine IFN-γ Control » « Green Diluent » « Wash Buffer – 20X Concentrate » 6- Conjugué (100X ) « Conjugate – 100X Concentrate » Anti-IFN-γ bovin marqué à la peroxydase de raifort 7- Diluent « Blue » « Blue Diluent » Tampon de dilution du conjugué 8- Solution de substrat enzymatique « Enzyme Substrate Buffer » 9- Solution Chromogène (100X) « Chromogen Solution -100X concentrate » 10- Solution de révélation "Enzyme Stopping Solution” 0.5M H2SO4 Les instructions de préparation sont en partie E-2&3 3/9 MAN0030314, Révision A Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France B – Documents complémentaires nécessaires Document Information nécessaire Certificat de vérification du lot du kit Bovigam Dilution du Contrôle positif à réaliser Certificat du MRC Pourcentage de positivité attendu Instructions françaises en vigueur Exemple: Critères d’interprétations sévères/intermédiaires C – Matrice Un prélèvement de sang de 10 mL minimum pour chaque animal dans un tube de prélèvement sanguin contenant de l'héparine (héparine de lithium de type CML VF109SHL ou autres) comme anticoagulant est nécessaire. Note : Le sang au moment du prélèvement doit être mélangé doucement par plusieurs retournements du tube pour dissoudre l'héparine. Les échantillons de sang doivent être transportés au laboratoire à température ambiante (T°C ambiante = 21 ± 5°C) en évitant les extrêmes. Il est recommandé d’effectuer la stimulation dans les 6 à 8 h maximum suivant le prélèvement. En aucun cas, le sang ne doit être conservé au réfrigérateur ni au congélateur. D – Réactifs nécessaires Phase expérimentale Nom réactif / kit Référence produit Recommandation de préparation et de conservation BOVIGAM™ Tuberculin PPD Stimulating Antigen, bovine (30,000 I.U./mL)_7600060 7600022 Conservation : à 2-8°C, ne pas congeler Préparation : Dilution au 1/9 extemporanément (110 µL PPD A ou B dans 890 µL de RPMI ou PBS) BOVIGAM™ Tuberculin PPD Stimulating Antigen, avian (25,000 I.U./mL)_7600065 Stimulation en plaque de culture cellulaire BOVIGAM™ Pokeweed Mitogen (flacon de 3.2 mg) 5108777 Reconstituer avec 64 mL de RPMI ou PBS Conserver à température ≤ −16°C BOVIGAM™ PC-EC Stimulating Antigen (lyophilisé) 7600100 Reconstituer avec 3 mL d’eau déionisée ou distillée. Note : après reconstitution et aliquotage, conserver à -80°C Pour plus de détails MAN0017011 RPMI-1640 Medium with sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture 31870017 Non applicable Sterile phosphate buffered salinePBS: (0.01M, pH 7.2) 20012027 Non applicable Plaques de culture cellulaire ELISA 4/9 Plus de détails sur les MAN0017035 et MAN0017038 Applied Biosystems™ BOVIGAM™ TB Kit (format 30 plaques) De type Dutscher 353072 ou VWR 39 13 325 ou TPP 92096 63326 Cf partie « Préparation des réactifs ELISA » Conserver le kit ELISA à 5 ± 3°C MAN0030314, Révision A Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France E – Protocole simplifié Collecter le sang en tube contenant de l’héparine (moins de 8 h avant stimulation) Stimulation en plaque de culture cellulaire (20-24 h à 37 ± 2°C) *cf note page 6 Centrifugation et récupération du plasma (10 min à 500 g) ELISA Mettre à T°C ambiante les réactifs sauf le conjugué à garder au réfrigérateur Préparer les réactifs ELISA selon les recommandations du paragraphe 2 de cette notice Analyse Note : L’analyse peut être réalisée avec un unique réplicat, cependant la réalisation d’un duplicat est conseillée et permet une meilleure reproductibilité. 1 – Stimulation en plaque de culture cellulaire Avant de réaliser la stimulation, veiller à amener les réactifs à T°C ambiante et à les mélanger soigneusement avant utilisation. Après utilisation les remettre immédiatement à température recommandée. Proposition de plan de plaque pour un test en réplicat unique : Ligne/colonne 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A 1N 1A 1B 1M 1PW CN 9N 9A 9B 9M 9PW B 2N 2A 2B 2M 2PW CN 10N 10A 10B 10M 10PW C 3N 3A 3B 3M 3PW CN 11N 11A 11B 11M 11PW D 4N 4A 4B 4M 4PW CP dil 12N 12A 12B 12M 12PW E 5N 5A 5B 5M 5PW CP dil 13N 13A 13B 13M 13PW F 6N 6A 6B 6M 6PW CP dil 14N 14A 14B 14M 14PW G 7N 7A 7B 7M 7PW Traceur 15N 15A 15B 15M 15PW H 8N 8A 8B 8M 8PW Traceur 16N 16A 16B 16M 16PW Réactifs « Stimulateur » : N = Nil Antigen (RPMI ou PBS) / A = PPD Aviaire / B = PPD Bovine / M = Mix Cocktail de peptide PC-EC / PW = Pokeweed Pour l’ELISA : CN = Contrôle Négatif (ELISA) / CP = Contrôle Positif (ELISA) / Traceur = matériel de référence « MRC » pouvant être fourni par le laboratoire de référence 5/9 MAN0030314, Révision A 12 Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France Agiter doucement les tubes de sang héparinés pendant 1 à 3 minutes (agitateur rotatif fortement recommandé) Note : Sur une paillasse différente de celle où les réactifs propres sont distribués, ou agiter postérieurement Distribuer 25 µL de chaque réactif (N/A/B/M/Pw) selon le plan ci-dessus dans la plaque de culture Distribuer 250 µl d’échantillon de sang par puits selon le plan de plaque (ex : éch. 1 en A1 à A5) Couvrir la plaque et homogénéiser à l’aide d’un agitateur de plaque 5 à 10 minutes à une vitesse équivalente à 600 rpm Incuber 20 à 24 heures* à 37 ± 2°C dans une boite humide fortement recommandé Centrifuger à 500 g pendant 10 minutes à T°C ambiante Transférer le plasma dans une nouvelle plaque identifiée. Conservation: 3 jours maximum à 5 ± 3°C, au-delà à une température ≤ −16°C Note : Si un duplicat a été réalisé, les plasmas peuvent être poolés puis testés sur 2 puits lors de l’ELISA. *Possibilité de faire une incubation au minimum de 16h : Seulement si les conditions d’incubation des plaques à 37°C sont maintenues pendant toute la période d’incubation. Toute évaporation doit être évitée. 6/9 MAN0030314, Révision A Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France 2 – Préparation des réactifs ELISA Avant et pendant l’ELISA Réactif Préparation Conservation et recommandations Contrôles positifs et négatifs Reconstituer les flacons appropriés avec 2 mL d'eau déionisée ou distillée. Ensuite, le contrôle positif doit être dilué selon le certificat qualité établi suite à la vérification du kit. Assurer une solubilisation complète. Conservation des contrôles reconstitués à 5 ± 3°C jusqu'à 3 mois. Diluant « Green » Utiliser de façon non diluée comme tampon de dilution du plasma. Amener à T°C ambiante et mélanger soigneusement. Conjugué (100X) Pour préparer la solution « mère » de Assurer une solubilisation complète sans le conjugué concentré 100X reconstituer vortexer avec une agitation douce. Le mélange (si possible la veille des analyses) le doit être effectué avec un minimum de mousse lyophilisat avec 2 mL d'eau déionisée ou (risque de dénaturation). Conserver la solution mère reconstituée distillée. Pendant les lavages de l’ELISA une immédiatement à 5 ± 3°C en continu et à dilution au 1/100e dans du tampon Blue utiliser dans les 3 mois suivant la sera à réaliser (~5 min avant utilisation). reconstitution. Tampon de lavage (20X) Amener la solution mère à température ambiante pour dissoudre les cristaux. Ensuite, diluer au 1/20e avec de l'eau déionisée ou distillée La solution 20X doit être conservée à 5 ± 3°C et celle à 1X à T°C ambiante pour une utilisation sur la journée ou à 5 ± 3°C jusqu’à 2 semaines. Bien remettre à température ambiante avant utilisation. Solution de substrat enzymatique Amener le tampon de substrat enzymatique et la solution de chromogène concentrée 100X à T°C ambiante. Bien les mélanger. Pendant les lavages de l’ELISA une dilution au 1/100e du chromogène est à réaliser : ajouter 0,12 mL de solution chromogène (pour 96 puits par exemple) dans 11,880 mL de solution de substrat enzymatique. Utiliser ce mélange dans les 10 min suivant la préparation. Si possible, utiliser des récipients jetables en plastique polypropylène stérilisés par irradiation pour préparer la solution de substrat enzymatique. La solution de substrat enzymatique doit être complètement mélangée et doit être incolore. Si une coloration bleue apparaît, la solution de substrat doit être éliminée. Diluer le MRC selon les recommandations de son certificat. Se référer aux recommandations fournies par le laboratoire de référence. Solution Chromogène (100X) Traceur (MRC) Notes : Ne pas utiliser de récipients ou de pipettes en polystyrène. Toute verrerie utilisée avec les réactifs du substrat enzymatique doit être soigneusement rincée avec du H2SO4 ou du HCI 1N, suivi d'au moins trois lavages à l'eau déionisée ou distillée, en veillant à ce qu'il ne reste aucun résidu d'acide sur la verrerie. 7/9 MAN0030314, Révision A Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France 3 – ELISA Avant l’ELISA, placer les réactifs à T°C ambiante (au moins 30 min à 1 h) avant utilisation, à l’exception du conjugué à garder à 5 ± 3°C après reconstitution. Dans une plaque : Distribuer 50 µL de diluant « Green » par puits (selon le plan de plaque du paragraphe 1) Ajouter dans les puits, selon le plan de plaque, 50 µL de chaque échantillon préalablement stimulé, et les témoins (contrôles kit et MRC) Couvrir et incuber à T°C ambiante pendant 60 ± 5 min., sous agitation (600 rpm) recommandée Préparer la solution de lavage : dilution au 1/20e dans de l’eau déionisée/distillée Réaliser au laveur 2 séries de 3 lavages (Ajouter 300 µL/puits de solution de lavage au 1/20e) Conseils : Temps d'attente de 15 secondes entre chaque plaque et de 1 à 2 minutes entre les 2 séries en ayant retourné la plaque à 180° sur le laveur Préparer le conjugué : dilution au 1/100e la solution mère dans le diluant "Blue" et bien mélanger Distribuer immédiatement 100 µL/puits du conjugué Couvrir et incuber à T°C ambiante pendant 60 ± 5min, sous agitation (600 rpm) recommandée Réaliser au laveur 2 séries de 3 lavages comme précédemment (Entre chaque rinçage, bien vider la plaque par retournement sec pour éliminer toute trace de conjugué.) Préparer la solution de révélation en diluant la solution chromogène au 1/100e dans le tampon de substrat enzymatique (dans les 10 minutes avant utilisation) Distribuer 100 µL/puits de la solution de révélation fraichement préparée Incuber à T°C ambiante (étuve à 21 +/- 5°C par exemple) pendant 20 à 30 min à l’obscurité sans agitation et sans film Note : si les contrôles montrent une forte coloration, la réaction peut être arrêtée après 20 minutes. Si la coloration des contrôles est faible, la réaction peut être continuée jusqu'à 30 minutes. Distribuer 50 µL/puits de la solution d’arrêt enzymatique Lire la DO de chaque plaque à 450 - 620 nm 8/9 MAN0030314, Révision A Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France F – Critère de validation de la plaque • Contrôle négatif IFN-γ bovin : moyenne des DO < 0.130 avec une variation < 0.040 entre les différentes valeurs de CN. • Contrôle positif de l'IFN-γ bovin dilué (selon les recommandations du certificat de vérification du kit Français établi suite à la vérification de celui-ci) : moyenne des DO > 0.550 avec un écart entre les différentes valeurs de DO du CP ≤ à 30 % de la DO attendue. • Si un traceur (MRC) est fourni par le laboratoire de référence : moyenne des DO puis calcul du pourcentage de positivité : % Réf. = [(DO MRC - DO CN)/ [3* (DO CP dilué - DO CN)]*100 o Pour la justesse, suivre les recommandations notifiées dans le certificat du MRC établi par le LNR. o Pour la reproductibilité, suivre votre carte de contrôle. Si l'un ou l'autre des critères ci-dessus n'est pas respecté, l’ELISA n'est pas validé et doit être répété. G – Calculs et critères d’interpretation des échantillons Si des réplicats ont été réalisés, calculer la moyenne pour chaque condition de stimulation. • Nil Control Antigen (RPMI ou PBS) : DO < 0.300 Si le PBS n’est pas valide le résultat de l’échantillon est dit « Ininterprétable ». • Pokeweed mitogen : DO > 0.500 Si la DO du Pokeweed est inférieur ou égal à 0.500, vérifier les calculs des rapports ci-dessous. Si les valeurs des rapports PPD, PPD B et Mix : o sont trouvées positives, l’échantillon est interprété « Positif ». o sont trouvées négatives et amenant à une interprétation finale négative, l’échantillon est « Ininterprétable ». Rapport PPD à calculer par échantillon : * ** Rapport Calcul Négatif Positif Positif fort PPD PPD Ech = (PPD B Ech - PPD A Ech)/ (3*( CP dilué - CN)) < 0.05 ≥ 0.05 ≥ 0.3 PPD B PPD B Ech= (PPD B EchPBS Ech)/ (3* (CP dilué - CN)) ≤ 0.7 > 0.7 Non applicable Mix « Cocktail de Peptide » PC/EC Mix Ech= (Mix Ech - PBS Ech)/(3*(CP dilué-CN)) < 0.03 > 0.03 ≥ 0.1 Calcul* : pour tout test réalisé en duplicat, utiliser la moyenne des valeurs Positif fort** : Critère qui n’est actuellement pas utilisé pour l’interprétation réglementaire Important Ces critères d’interprétation dépendent des instructions réglementaires françaises et peuvent être modifiés. Il en est de même pour les critères d’interprétation dite « Sévère » ou « Intermédiaire » (non présentés). Veuillez suivre les mises à jour de ces instructions données par la DGAL. 9/9 MAN0030314, Révision A BOVIGAM TB Kit_cover_MAN0030314-v2-GUID-D752142A-87F0-477FAA69-16B35DBD47CE-2024/04/29 20:18:06 fr 17:03:54.007-05:00 thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 14 février 2025 ">
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