Fenêtre Photométrique. Fisher Bioblock Scientific UVProbe
3 Le Module Photométrique, Leçon 2
Chapitre 3 Le Module
Photométrique, Leçon 2
Le principal objectif du module photométrique est de déterminer la concentration d'une substance dans un
échantillon, prendre des mesures avec un spectrophotomètre pour créer des courbes standard et les utiliser pour calculer la valeur de concentration d'échantillons inconnus et des valeurs sur la base d'équations pouvant
être créées et personnalisées.
Le module comporte quatre volets : Standard table (Tableau standard), Standard Curve (Courbe standard),
Sample/S.E.P. table (Tableau échantillon/ETP) et Sample graph (Graphique échantillon). Chaque volet ne dispose que d'une fonction, à l'exception du volet Sample/S.E.P. table (Tableau échantillon/ETP) qui peut afficher un tableau échantillon ou un tableau d'erreur-type de prédiction (consulter l'aide en ligne pour plus d'informations sur le basculement entre ces tableaux).
Cette leçon comporte les trois exercices suivants :
• Mesures de base
• Opérations photométriques de base
• Techniques photométriques avancées
TABLE DES MATIÈRES
3.1
Fenêtre Photométrique...................................................................................................................... 3-2
3.2
Barre d'Outils Photométrique............................................................................................................. 3-3
3.3
Définir et Editer une Méthode Photométrique ................................................................................... 3-4
3.4
Exercice 1 - Mesures de Base........................................................................................................... 3-7
<Partie 1 - Créer une Courbe Standard> .......................................................................................... 3-7
<Partie 2 - Mesurer des Echantillons Standard> ............................................................................... 3-9
<Partie 3 - Lire des Echantillons Inconnus> .................................................................................... 3-13
3.5
Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base........................................................................... 3-16
3.6
Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées ....................................................................... 3-23
<Partie 1 - Equations Personnalisées> ........................................................................................... 3-23
<Partie 2 - Utiliser unSipper pour Collecter des Données> ............................................................. 3-29
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Formation UVProbe 3-1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.1
3.1
Fenêtre Photométrique
Tableau standard Barre d'outils photométrique Courbe standard
Tableau échantillon
Nom du fichier
Nombre de répétitions
Graphique échantillon
Fenêtre du passeur de cuves
3-2 Formation UVProbe
3.2
3.2
Barre d'Outils Photométrique
View Standard Table
(Afficher le tableau standard)
View Sample Table
(Afficher le tableau échantillon)
View S.E.P. Table
(Afficher le tableau ETP)
Settings (Paramètres)
Properties (Propriétés)
Method (Méthode)
Make Standard
(Rendre standard)
View Standard Curve
(Afficher la courbe standard)
View Sample Graph
(Afficher le graphique échantillon)
Manipulate (Manipuler)
File Properties (Propriétés du fichier)
Statistical Analysis
(Analyse statistique)
Blank Subtraction
(Soustraction de blanc)
Standard Error of Prediction (Erreur-type de prédiction)
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Formation UVProbe 3-3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.3
3.3
Définir et Editer une Méthode Photométrique
Lorsqu'une nouvelle méthode photométrique est créée, l'assistant de la méthode photométrique démarre.
Effectuer la méthode en fonction des instructions de l'assistant.
Si une méthode photométrique a déjà été créée ou si le fichier Méthode est ouvert, l'assistant ne démarre pas et la page de propriétés de la méthode photométrique s'ouvre. La méthode de mesure créée peut être éditée à ce stade. Il existe toutefois des paramètres qui empêchent l'édition si les mesures d'échantillon ont déjà commencé.
Méthode de mesure récemment créée
Edition d'une méthode de mesure
Créer une méthode de mesure
Lorsqu'une nouvelle méthode photométrique est créée, l'assistant de méthode photométrique démarre.
Effectuer la méthode de mesure en fonction des instructions de l'assistant.
1.
Lorsque la fenêtre photométrique n'est pas ouverte, sélectionner Photometric (Photométrique) dans le menu Window (Fenêtre) pour activer le module photométrique.
2.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau).
3.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode).
4.
L'assistant de la méthode photométrique démarre.
Définir les longueurs d'onde
Cette fenêtre permet de définir la longueur d'onde et la plage de longueurs d'onde à mesurer. La longueur d'onde ou la plage de longueurs d'onde définie ici est ajoutée sous forme de colonne dans le tableau. La valeur mesurée est indiquée dans chaque colonne de longueur d'onde ou de plage de longueurs d'onde.
1.
Sélectionner Point ou Range (Plage) dans la zone Wavelength Type (Type de longueur d'onde).
2.
Si Point a été sélectionné, procéder comme suit :
Ajouter une longueur d'onde par point (longueur d'onde de mesure)
3.
Si Range (Plage) a été sélectionné, procéder comme suit :
Ajouter une longueur d'onde par plage. (plage de longueurs d'onde de mesure)
4.
Cliquer sur le bouton Next (Suivant).
3-4 Formation UVProbe
3.3 Définir et Editer une Méthode Photométrique
<<Exercice 1 - Partie 1 - Etape 1>>
Démarrer l'assistant de la méthode photométrique
Page Photometric Method Wizard - [Wavelength] (Assistant de la méthode photométrique - [Longueur d'onde])
Page Photometric Method Wizard - [Calibration] (Assistant de la méthode photométrique - [Etalonnage])
Sélectionner [Multi point] (Multipoint) ou
[Single Point] (Unipoint)
Sélectionner [K-Factor] (Facteur K) ou
[Raw Data] (Données brutes)
Page Photometric Method Wizard - [Measurement Parameter (Standard Table)]
(Assistant de la méthode photométrique - [Paramètre de mesure (Tableau standard)])
Page Photometric Method Wizard - [Measurement Parameter (Sample Table)]
(Assistant de la méthode photométrique - [Paramètre de mesure (Echantillon standard)])
Page Photometric Method Wizard - [File Properties]
(Assistant de la méthode photométrique - [Propriétés du fichier])
Fermer l'assistant de la méthode photométrique
Boîte de dialogue Photometric Method (Méthode photométrique) - Définir l'autre paramètre
<<Exercice 1 - Partie 1 - Etape 2>> Sauvegarder une méthode de collecte de données
[Fichier Photometric Method (Méthode photométrique) (*.pmd)]
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Compléter un tableau standard ou échantillon (page suivante *)
Formation UVProbe 3-5
3.3 Définir et Editer une Méthode Photométrique
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
<<Exercice 1 - Partie 2 - Etape 1>>
Fichier Photometric Method (Méthode photométrique)
(*.pmd)
File (Fichier) Open (Ouvrir)
* Créer une méthode de collecte de données
[K-Factor] (Facteur K) ou
[Raw Data] (Données brutes)
Fenêtre [File Properties] (Propriétés du fichier)
[Multi point] (Multipoint) ou
[Single Point] (Unipoint)
<<Exercice 1 - Partie 2 - Etape 2>> Compléter un tableau standard
<<Exercice 1 - Partie 2 - Etape 3>> Lire l'échantillon standard
<<Exercice 1 - Partie 1 - Etape 5>>
Sauvegarder le tableau standard
[Fichier Standard Table (Tableau standard) (*.std)]
3
<<Exercice 1 - Partie 3 - Etape 1>> Créer un tableau échantillon
3-6
<<Exercice 1 - Partie 3 - Etape 2>> Lire l'échantillon inconnu
<<Exercice 1 - Partie 3 - Etape 4>> Sauvegarder les données
[Fichier Photometric (Photométrique) (*.pho) ]
REMARQUE
Les fichiers photométriques contiennent des informations relatives aux tableaux Standard et
Echantillon.
Sauvegarder les données
[Fichier Unknown (Inconnu) (*.unk)]
REMARQUE
Les fichiers inconnus contiennent des informations relatives au tableau échantillon.
Formation UVProbe
3.4
3.4
Exercice 1 - Mesures de Base
Dans cet exercice :
• Créer une courbe standard
• Lire des échantillons inconnus
<Partie 1 - Créer une Courbe Standard>
Avant de commencer :
• Sélectionner Window (Fenêtre) > Photometric (Photométrique) pour ouvrir le module correspondant.
• Vérifier que l'instrument est connecté.
• Corriger la ligne de base (voir Leçon 1, page 2-1).
Pour créer et afficher une courbe standard :
• Créer une méthode de collecte de données
3.4.1 Etape 1 - Créer une Méthode de Collecte de Données
Créer une méthode de collecte de données pour réaliser une courbe standard multipoint. La méthode mesure l'absorbance à 530 et 550 nm et calcule le coefficient d'absorbance entre deux longueurs d'onde.
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau) ou cliquer sur l'icône New (Nouveau) sur la barre d'outils.
2.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode) ou cliquer sur l'icône Method (Méthode) sur la barre d'outils.
3.
Démarrer l'assistant de la méthode photométrique.
4.
Dans la zone Wavelength(nm) (Longueur d'onde (nm)), entrer 530 et cliquer sur Add (Ajouter) pour spécifier la longueur d'onde à laquelle les données seront collectées. Entrer ensuite 550 et cliquer sur Add (Ajouter).
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
5.
Cliquer sur Next (Suivant) et laisser tous les autres paramètres sur leurs valeurs par défaut.
Formation UVProbe 3-7
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3-8
6.
Dans la zone Type, sélectionner Multi Point (Multipoint) pour baser la courbe standard sur des points de données multiples.
7.
Dans la zone Formula (Formule), sélectionner Ratio (Coefficient).
8.
Dans la zone WL1 (LO1), sélectionner WL530.0 (LO530,0).
9.
Dans la zone WL2 (LO2), sélectionner WL550.0 (LO550,0).
10. Vérifier que Result (Résultat) est sélectionné dans la zone Column Name (Nom de la colonne) pour créer une colonne de résultat dans le tableau. Pour chaque échantillon lu, le résultat indique la lecture de l'absorbance à 530 nm divisée par la lecture de l'absorbance à 550 nm.
11. Dans la zone Order of Curve (Ordre de la courbe) , sélectionner 3rd (Troisième).
12. Cliquer sur Next (Suivant).
13. La page Measurement Parameter (Paramètre de mesure) s'affiche pour le tableau échantillon standard. Sur cette page, la méthode d'acquisition de données (manuelle ou instrumentale) du tableau échantillon standard peut être définie mais aucune modification ne doit être apportée.
Cliquer sur le bouton Next (Suivant).
14. La page Measurement Parameter (Paramètre de mesure) s'affiche pour le tableau échantillon inconnu. Sur cette page, la méthode d'acquisition de données (manuelle ou instrumentale) du tableau échantillon inconnu peut être définie mais aucune modification ne doit être apportée.
Cliquer sur le bouton Next (Suivant).
15. La page File Properties (Propriétés du fichier) s'affiche. N'effectuer aucune modification et cliquer sur le bouton Finish (Terminer).
REMARQUE
Cette page définit les informations relatives au fichier des données à mesurer. Lorsque des mesures sont effectuées suivant la création d'une méthode de mesure, entrer les noms de fichier et d'autres informations sur cette page. Cette section décrit la procédure de création et de sauvegarde de la méthode de mesure. Les paramètres de la page ne sont donc pas décrits.
16. La fenêtre Photometric Method (Méthode photométrique) s'ouvre. Cliquer sur l'onglet Instrument
Parameters (Paramètres de l'instrument).
Formation UVProbe
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
17. Sélectionner Absorbance dans la liste Measuring Mode (Mode de mesure).
18. Dans la zone Slit Width (nm) (Largeur de la fente (nm)), sélectionner 2,0 (lorsque l'instrument dispose d'une largeur de fente déterminée, ignorer cette étape). Laisser tous les autres paramètres sur leurs valeurs par défaut.
19. Cliquer sur Close (Fermer). Vérifier que les tableaux standard et échantillon comportent les colonnes LO530,0, LO550,0 et Result (Résultat).
3.4.2 Etape 2 - Sauvegarder une Méthode de Collecte de Données
Il est parfois utile de sauvegarder une méthode de collecte de données pouvant être utilisée ultérieurement pour collecter de nouvelles données. La méthode en cours est sauvegardée comme fichier .pmd et utilisée dans les exercices suivants.
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous), puis vérifier que le répertoire Data
(Données) est sélectionné dans la zone Save In (Enregistrer dans).
2.
Dans la zone File Name (Nom du fichier), entrer MéthPhoto.
3.
Dans la liste Save As Type (Type de fichier), cliquer sur Methods (Méthodes) (*.pmd) et sur Save
(Enregistrer).
<Partie 2 - Mesurer des Echantillons Standard>
Effectuer l'opération suivante pour créer et afficher la courbe d'étalonnage à l'aide de la méthode de mesure créée et sauvegardée dans la partie 1.
• Entrer les informations du fichier
• Créer un tableau échantillon standard
• Mesurer l'échantillon standard
• Afficher la courbe d'étalonnage
Avant de commencer, préparer cinq échantillons standard avec des valeurs de concentration différentes.
REMARQUE
Il n'est pas nécessaire de préparer des échantillons standard si les données sont entrées manuellement. Dans pareil cas, utiliser les mêmes opérations dans la procédure suivante.
Lors de la saisie des données, entrer les mêmes valeurs que celles indiquées comme résultats manuels.
Formation UVProbe 3-9
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
3.4.3 Etape 1 - Entrer les Informations du Fichier
Définir les informations telles que le nom de fichier des données à mesurer. Si la méthode de mesure existante est utilisée, elle doit être entrée avant la mesure.
REMARQUE
Pour créer une méthode de mesure et effectuer les mesures, entrer les informations du fichier dans l'assistant de la méthode de mesure.
Cette section décrit la procédure de prise de mesures à l'aide de la méthode de mesure sauvegardée.
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau) pour effacer la méthode de mesure existante.
2.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir). Vérifier que les données du répertoire Data
(Données) sont affichées.
3.
Sélectionner File Type (Type de fichier) > Measurement Method File (Fichier de méthode de mesure) (*.pmd). "Double-cliquer" sur MéthPhoto.std dans la liste de fichiers pour l'ouvrir.
4.
La fenêtre File Properties (Propriétés du fichier) s'ouvre. Entrer "Photo1" dans la boîte de dialogue File Name (Nom du fichier). Il n'est pas nécessaire d'entrer l'extension du fichier.
5.
Lorsqu'un titre ou un commentaire est ajouté aux données de mesure à titre indicatif, les entrer respectivement dans les boîtes de dialogue Title (Titre) et Comment (Commentaire). Il convient toutefois de les laisser vierges dans ce cas.
6.
Cliquer sur le bouton Close (Fermer).
3.4.4 Etape 2 - Compléter un Tableau Standard
Un tableau standard est un tableau de résultats (absorbance, transmission, énergie ou réflectance) obtenus pour des concentrations connues d'une substance à une ou des longueurs d'onde spécifiques.
Les colonnes WL530.0 (LO530,0), WL550.0 (LO550,0) et Result (Résultat) ont été ajoutées au tableau.
Les ID échantillon et les valeurs de concentration sont maintenant ajoutés pour créer un tableau standard.
Entrer les ID échantillon et la concentration du tableau standard
1.
Cliquer n'importe où dans le tableau standard pour l'activer. (Active) (Actif) s'affiche dans l'en-tête.
3
2.
Entrer les ID échantillon et les valeurs de concentration suivants dans le tableau.
Sample ID (ID échantillon)
DyeA (ColorantA)
DyeB (ColorantB)
DyeC (ColorantC)
DyeD (ColorantD)
DyeE (ColorantE)
Concentration
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Le tableau doit ressembler à la figure suivante.
3-10 Formation UVProbe
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
3.4.5 Etape 3 - Lire les Echantillons Standard
Le spectrophotomètre est utilisé pour mesurer chaque échantillon standard. UVProbe utilise ensuite les données acquises pour créer une courbe standard.
REMARQUE
Pour entrer manuellement des valeurs dans le tableau au lieu d'effectuer des lectures de l'instrument, se reporter à la section Entrer manuellement des données de courbe standard à la page suivante.
Lire les échantillons
1.
Cliquer sur le bouton Connect (Connecter) sur la barre de boutons du photomètre. La barre doit maintenant ressembler à la figure suivante.
2.
Placer le premier échantillon standard dans le compartiment échantillon. Cliquer sur le bouton
Read Std. (Lire std.) ou appuyer sur la touche F9.
REMARQUE
Lorsque le message suivant s'affiche, cliquer sur Yes (Oui). "There is no associated blank for
this standard. Do you wish to continue?" ("Il n'existe pas de blanc associé à cet échantillon standard. Voulez-vous continuer ?")
Le spectrophotomètre balaye rapidement chaque longueur d'onde et mesure l'absorbance.
UVProbe entre les valeurs WL530.0 (LO530,0), WL550.0 (LO550,0) et Result (Résultat) dans le tableau standard.
3.
Une fois le balayage rapide terminé, placer chacun des cinq échantillons dans le compartiment
échantillon pour effectuer une lecture.
REMARQUE
Lorsque la définition de la méthode (longueur d'onde, largeur de la fente, etc.) est terminée, entrer l'ID échantillon et la concentration dans le tableau standard. Cette opération active le bouton <Read Std. (Lire std.)> et permet de lire les données standard.
Entrer manuellement des données de courbe standard (étape facultative)
REMARQUE
Ignorer cette étape lors de la lecture des concentrations avec le spectrophotomètre.
1.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode) > onglet Measurement Parmeters (Standard)
(Paramètres de mesure (Standard)) et vérifier que les données sont acquises par une information utilisateur qui permet d'entrer les valeurs de longueur d'onde directement dans le tableau.
2.
Cliquer sur Close (Fermer).
Entrer les valeurs suivantes dans le tableau standard :
Sample ID
(ID échantillon)
DyeA (ColorantA)
DyeB (ColorantB)
DyeC (ColorantC)
DyeD (ColorantD)
DyeE (ColorantE)
Concentration
0
25
50
75
100
WL530.0 (LO530,0)
0,040
0,300
0,520
0,920
1,080
WL550.0 (LO550,0)
0,040
0,050
0,030
0,175
0,070
Formation UVProbe 3-11
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
Lorsque que UVProbe a calculé les résultats, le tableau doit ressembler à la figure suivante.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.4.6 Etape 4 - Afficher la Courbe Standard
Il est maintenant possible d'afficher la courbe créée à partir du tableau standard et de modifier l'ordre de la courbe. Observer les changements sur le graphique.
1.
Sélectionner View (Affichage) > Standard Curve (Courbe standard) pour afficher une courbe semblable à la suivante :
Un point s'affiche pour chaque ID échantillon.
2.
Pour modifier l'ordre de la courbe, sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode) ou cliquer sur l'icône Method (Méthode). Cliquer sur l'onglet Calibration (Etalonnage). Mettre la courbe en 2 e position, puis cliquer sur Close (Fermer) pour afficher le graphique suivant :
3
3-12
3.
Répéter les étapes précédentes et mettre la courbe en 1
ère
position.
Comme illustré, la courbe en 3 e courbe de la 1
ère
position correspond le plus aux points de données alors que la
position (non illustrée) crée une ligne droite.
4.
Mettre la courbe en 3 e
position.
3.4.7 Etape 5 - Sauvegarder le Tableau Standard
Le tableau standard est maintenant sauvegardé pour une utilisation ultérieure dans cette leçon.
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous) et vérifier que le répertoire Data
(Données) est sélectionné dans la zone Save In (Enregistrer dans).
2.
Entrer Standard1 dans la zone File Name (Nom du fichier), puis sélectionner Standard Files
(Fichiers standard) (*.std) dans la liste Save As type (Type de fichier).
3.
Cliquer sur Save (Enregistrer).
Formation UVProbe
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
<Partie 3 - Lire des Echantillons Inconnus>
La courbe standard est maintenant utilisée pour calculer la concentration d'échantillons inconnus et effectuer les opérations suivantes :
• Compléter un tableau échantillon
• Lire des échantillons inconnus
• Afficher le graphique échantillon
Avant de commencer, préparer cinq échantillons inconnus de nature identique.
3.4.8 Etape 1 - Créer un Tableau Echantillon
Un tableau échantillon est un tableau de valeurs (absorbance, transmission, énergie ou réflectance) pour des concentrations inconnues d'une substance. UVProbe utilise la courbe standard pour calculer la concentration de chaque entrée du tableau échantillon.
La méthode de collecte de données est identique pour les deux tableaux, à l'exception des informations du paramètre de mesure. Entrer les ID échantillon pour chacun des échantillons inconnus préparés.
1.
Cliquer n'importe où dans le tableau échantillon pour l'activer. (Active) (Actif) s'affiche dans l'en-tête.
2.
Entrer les valeurs suivantes dans la colonne Sample ID (ID échantillon) du tableau échantillon :
DyeF, DyeG, DyeH, DyeI, DyeJ (ColorantF, ColorantG, ColorantH, ColorantI, ColorantJ). Le tableau doit ressembler à la figure suivante.
3.4.9 Etape 2 - Lire l'Echantillon Inconnu
Effectuer maintenant une lecture des échantillons inconnus sauf si les données sont entrées manuellement.
Pour entrer manuellement des valeurs dans le tableau échantillon au lieu d'effectuer des lectures de l'instrument, se reporter à la section Entrer Manuellement des Données du Tableau Echantillon ci-dessous.
REMARQUE
Remplir le tableau échantillon standard en entrant manuellement les données.
Dans le tableau échantillon, définir la méthode de collecte de données sur Manual (Manuelle) sur la page Measurement Parameter (Standard Sample) (Paramètre de mesure (Echantillon standard)) de la méthode de mesure photométrique.
1.
Placer un échantillon inconnu dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
2.
Cliquer sur le bouton Read Unk (Lire inc.).
L'instrument effectue une lecture à chaque longueur d'onde et détermine la concentration de l'échantillon en comparant les résultats calculés à la courbe standard.
3.
Répéter cette procédure pour les quatre autres échantillons inconnus. Noter les résultats. Les valeurs de concentration se basent sur la courbe standard.
REMARQUE
Sauvegarder les échantillons pour les utiliser dans l'exercice 2.
REMARQUE
Lorsque la définition de la méthode (longueur d'onde, largeur de la fente, etc.) est terminée, entrer
Sample ID (ID échantillon) dans le tableau échantillon. Cette opération active le bouton <Read
Unk. (Lire inc.)> et permet de lire les données inconnues.
Formation UVProbe 3-13
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.4.10 Etape 3 - Entrer Manuellement des Données du Tableau Echantillon
Une fois les lectures des échantillons préparés effectuées, passer à la section ci-dessous Afficher le
Graphique Echantillon.
1.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode).
2.
Dans l'onglet Measurement Parameters (Sample) (Paramètres de mesure (Echantillon)), sélectionner User Entry (Information utilisateur) pour activer la saisie manuelle des valeurs de longueur d'onde directement dans le tableau.
3.
Cliquer sur Close (Fermer).
4.
Entrer les valeurs suivantes dans le tableau échantillon :
Sample ID
(ID échantillon)
DyeF (ColorantF)
DyeG (ColorantG)
DyeH (ColorantH)
DyeI (ColorantI)
DyeJ (ColorantJ)
WL530.0 (LO530,0)
0,150
0,400
0,650
0,840
1,000
Le tableau doit ressembler à la figure suivante.
WL550.0 (LO550,0)
0,035
0,031
0,095
0,130
0,068
3
REMARQUE
Lorsque la courbe n'est pas placée en 3 e
position, les résultats sont différents.
3.4.11 Etape 4 - Afficher le Graphique Echantillon
L'ordre de la courbe est maintenant modifié pour afficher les effets sur le tableau et le graphique
échantillon.
Modifier l'ordre de la courbe
1.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode).
2.
Cliquer sur l'onglet Calibration (Etalonnage), puis mettre la courbe en 1
ère
position.
3.
Cliquer sur Close (Fermer) et observer le changement des concentrations.
3-14
4.
Répéter la procédure ci-dessus et mettre la courbe en 2 e
position. Le cinquième point ne peut pas être tracé. La concentration ne peut pas être déterminée étant donné que le résultat de Dye
J (Colorant J) n'est pas placé en 2 e
position.
Formation UVProbe
3.4 Exercice 1 - Mesures de Base
5.
Mettre la courbe en 3 e
position.
3.4.12 Etape 5 - Sauvegarder les Données
Les données des tableaux standard et échantillon sont sauvegardées. Les fichiers photométriques contiennent des informations relatives au tableau standard et échantillon.
Comme le nom du fichier est défini lors du chargement de la méthode de mesure, le fichier est écrasé pendant la sauvegarde.
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save (Enregistrer).
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Formation UVProbe 3-15
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.5
3.5
Exercice 2 - Opérations Photométriques de
Base
Dans cet exercice :
• Utiliser le remplissage automatique et répéter le balayage pour créer un tableau standard
• Utiliser les répétitions pour créer un tableau standard
• Calculer les concentrations inconnues à l'aide de plusieurs courbes standard
• Afficher les statistiques
• Effectuer une opération réversible sur les données
REMARQUE
Utiliser les échantillons créés au premier exercice dans cet exercice.
3.5.1 Etape 1 - Utiliser le Remplissage Automatique pour Créer un Tableau
Standard
Une méthode précédemment sauvegardée s'ouvre et la fonction de remplissage automatique est utilisée pour compléter un tableau standard, qui sera sauvegardé et utilisé ultérieurement dans cet exercice.
Ouvrir une méthode sauvegardée
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau).
2.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir). Vérifier que le répertoire de données approprié est ouvert.
3.
Dans la zone Files of Type (Type de fichier), sélectionner Methods (Méthodes) (*.pmd) et doublecliquer sur MéthPhoto.
La fenêtre File Properties (Propriétés du fichier) s'ouvre. A ce stade, le fichier n'est pas sauvegardé.
N'effectuer aucune modification et cliquer sur le bouton Close (Fermer).
Utiliser le remplissage automatique pour nommer les ID échantillon
1.
Cliquer sur l'icône Method (Méthode).
2.
Dans la section Data Acquired By (Données acquises par), cliquer sur le bouton Instrument, puis sur Close (Fermer).
3.
Cliquer avec le bouton droit sur le tableau standard et sélectionner Properties (Propriétés) dans le menu contextuel.
4.
Cocher la case Auto Fill (Remplissage automatique). Les zones Sample ID Name (Nom de l'ID
échantillon) et Step Value (Valeur du pas) sont activées.
5.
Entrer Batch (Lot) dans la zone Sample ID Name (Nom de l'ID échantillon), puis cliquer sur le tableau standard pour fermer la page Properties (Propriétés).
3-16
6.
Pour le lot de l'ID échantillon, entrer 1,0 dans la colonne Conc. (Concentration) du tableau standard.
7.
Placer un échantillon standard dans le compartiment échantillon de l'instrument.
Formation UVProbe
3.5 Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base
8.
Cliquer sur Read Std (Lire std).
REMARQUE
Lorsque le message suivant s'affiche, cliquer sur Yes (Oui). "There is no associated blank for
this standard. Do you wish to continue?" ("Il n'existe pas de blanc associé à cet échantillon standard. Voulez-vous continuer ?")
Une fois la lecture terminée, le nom de l'ID échantillon est automatiquement entré pour l'échantillon suivant.
9.
Répéter les étapes ci-dessus pour les quatre autres échantillons en utilisant des valeurs de concentration de 2 à 5.
Sauvegarder le tableau standard
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous). Vérifier que le répertoire Data
(Données) est sélectionné dans la zone Save In (Enregistrer dans).
2.
Dans la zone File name (Nom du fichier), entrer RemplissageAuto, puis sélectionner Standard
Files (Fichiers standard) (*.std) dans la liste Save as Type (Type de fichier).
3.
Cliquer sur Save (Enregistrer).
3.5.2 Etape 2 - Utiliser les Répétitions pour Compléter un Tableau Standard
Un autre tableau standard est créé avec le fichier MéthPhoto.pmd et les répétitions sont utilisées pour prendre les mesures.
Ouvrir une méthode sauvegardée
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau).
2.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir). Vérifier que le répertoire Data (Données) est ouvert.
3.
Dans la zone Files of Type (Type de fichier), sélectionner Methods (Méthodes) (*.pmd) et doublecliquer sur MéthPhoto.
La fenêtre File Properties (Propriétés du fichier) s'ouvre. A ce stade, le fichier n'est pas sauvegardé.
N'effectuer aucune modification et cliquer sur le bouton Close (Fermer).
Utiliser les répétitions pour prendre une mesure
1.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode). Vérifier que Instrument est sélectionné dans la zone Data Acquired By (Données acquises par).
2.
Cliquer sur l'onglet Measurement Parameters (Paramètres de mesure), définir les répétitions de l'échantillon sur 3 et cliquer sur Close (Fermer).
REMARQUE
Pour afficher un message après chaque lecture et activer l'option permettant de modifier les
échantillons, cocher la case Prompt Before Repeat (Demander confirmation avant de répéter) dans l'onglet Measurement Parameters (Paramètres de mesure).
3.
Entrer les concentrations et les ID échantillon suivants dans le tableau standard.
Sample ID (ID échantillon)
BatchA (LotA)
BatchB (LotB)
BatchC (LotC)
BatchD (LotD)
Concentration
4
6
1
3
4.
Placer un échantillon standard dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
5.
Cliquer sur le bouton Read Std (Lire std).
REMARQUE
Lorsque le message suivant s'affiche, cliquer sur Yes (Oui). "There is no associated blank for
this standard. Do you wish to continue?" ("Il n'existe pas de blanc associé à cet échantillon standard. Voulez-vous continuer ?")
L'instrument effectue trois lectures et les ID échantillon sont automatiquement mis à jour.
Formation UVProbe 3-17
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.5 Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6.
Répéter les étapes 4 et 5 pour les 3 autres ID échantillon.
REMARQUE
Pour définir le nombre de répétitions de l'échantillon inconnu, entrer le nombre dans la zone
Sample Repetitions (Répétitions échantillon) de la page Measurement Parameter (Sample)
(Paramètre de mesure (Echantillon)) de la méthode photométrique.
Masquer les répétitions
1.
Cliquer avec le bouton droit sur le tableau standard.
2.
Cliquer sur Show Repeats (Afficher les répétitions). Dans la colonne Type, seules les moyennes de chaque ensemble de répétitions s'affichent.
3
3-18
Sauvegarder le tableau standard
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous). Vérifier que le répertoire Data
(Données) est sélectionné dans la zone Save In (Enregistrer dans).
2.
Dans la zone File name (Nom du fichier), entrer Répétition, puis sélectionner Standard Files
(Fichiers standard) (*.std) dans la liste Save as Type (Type de fichier).
3.
Cliquer sur Save (Enregistrer).
3.5.3 Etape 3 - Utiliser Diverses Courbes Standard pour Calculer des
Concentrations Inconnues
Les concentrations d'échantillons inconnus sont calculés sur la base d'une courbe standard. Lorsque une courbe standard différente est utilisée, les calculs de concentration changent. Observer les changements des calculs de concentrations des échantillons lorsque plusieurs courbes standard sont utilisées.
REMARQUE
Utiliser les échantillons inconnus créés à l'exercice 1 pour cette étape.
Ouvrir un tableau standard
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau) pour effacer le tableau standard existant.
2.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir).
3.
Dans la liste Files of Type (Type de fichier), sélectionner Standard Files (Fichiers standard) (.std) et double-cliquer sur le fichier Standard1.std.
4.
La fenêtre File Properties (Propriétés du fichier) s'ouvre. Entrer "Concentration" dans la zone File name (Nom du fichier). Il n'est pas nécessaire d'entrer l'extension du fichier.
5.
Lorsqu'un titre ou un commentaire est ajouté aux données de mesure à titre indicatif, les entrer respectivement dans les boîtes de dialogue Title (Titre) et Comment (Commentaire). Il convient toutefois de les laisser vierges dans ce cas.
6.
Cliquer sur le bouton Finish (Terminer).
Formation UVProbe
3.5 Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base
Lire un échantillon inconnu
REMARQUE
Pour entrer manuellement des données dans le tableau échantillon, se reporter à l'exercice 1,
Entrer Manuellement des Données du Tableau Echantillon à la page 3-14 avant de poursuivre.
1.
Placer un échantillon inconnu dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
2.
Entrer EchantillonA pour le premier ID échantillon, EchantillonB pour le deuxième, EchantillonC pour le troisième et EchantillonD pour le quatrième.
3.
Cliquer sur le bouton Read Unk (Lire inc.). L'instrument effectue une lecture à chaque longueur d'onde et détermine la concentration de l'échantillon en comparant les résultats calculés à la courbe standard.
4.
Répéter les étapes ci-dessus pour chaque échantillon lu.
Sauvegarder un fichier
REMARQUE
Comme le nom du fichier est défini lors du chargement du tableau standard, le fichier est
écrasé pendant la sauvegarde.
1.
Sélectionner File (Fichier) > Overwrite (Ecraser)
Comparer des concentrations avec différents tableaux standard
1.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir).
2.
Sélectionner Standard Sample File (Fichier échantillon standard) (*.std) dans la liste File Type
(Type de fichier) et double-cliquer sur "RemplissageAuto.std" pour l'ouvrir.
3.
La fenêtre File Properties (Propriétés du fichier) s'ouvre. A ce stade, le fichier n'est pas sauvegardé. N'effectuer aucune modification et cliquer sur le bouton Close (Fermer).
4.
Les valeurs de la colonne Concentration du tableau échantillon sont différentes.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
5.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir).
6.
Sélectionner Standard Sample File (Fichier échantillon standard) (*.std) dans la liste File Type
(Type de fichier) et double-cliquer sur "RemplissageAuto.std" pour l'ouvrir.
7.
La fenêtre File Properties (Propriétés du fichier) s'ouvre. A ce stade, le fichier n'est pas sauvegardé. N'effectuer aucune modification et cliquer sur le bouton Close (Fermer).
8.
Les valeurs de la colonne Concentration du tableau échantillon sont différentes.
Formation UVProbe 3-19
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.5 Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base
3.5.4 Etape 4 - Afficher les Statistiques
Des équations numériques et des statistiques graphiques (95% Confidence Level (Niveau de confiance 95 %) et Standard Error of Prediction (Erreur-type de prédiction)) peuvent s'afficher sur le graphique de la courbe standard à l'aide de la page Properties (Propriétés). L'option 95% Confidence
Level (Niveau de confiance 95 %) (également appelée bande de confiance 95 %) définit la plage de concentration dans laquelle 95 des 100 échantillons répétés devraient se trouver. L'option Standard
Error of Prediction (Erreur-type de prédiction) permet de mesurer la différence entre les valeurs réelles (valeurs chimiques par voie humide) et prévues pour les échantillons hors de l'étalonnage défini lors de l'utilisation d'une courbe d'étalonnage spécifique.
Afficher des équations numériques sur la courbe standard
1.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir).
2.
Dans le répertoire Data (Données), double-cliquer sur Photo1.pho.
3.
Sélectionner View (Affichage) > Properties (Propriétés).
4.
Afficher au premier plan la page Properties (Propriétés), puis cliquer sur la courbe standard pour afficher la boîte de dialogue Standard Curve Properties (Propriétés de la courbe standard) illustrée ci-dessous.
5.
Cocher les cases en regard de Equation, Correlation Coefficient (Coefficient de corrélation) et
Residual Standard Deviation (Ecart résiduel standard). Les statistiques s'affichent en bas à gauche de la courbe standard.
Courbe standard
3
Conc. (mg/l) y = 0,00008 x3 - 0,01422 x2 + 0,71800 x - 0,07714
Coefficient de corrélation r2 = 0,39964
Ecart résiduel standard = 4,50601
3-20 Formation UVProbe
3.5 Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base
Afficher des statistiques graphiques sur la courbe standard
1.
Mettre la courbe d'étalonnage en 1
ère
position.
2.
Sur la page Properties (Propriétés), cocher les cases en regard de 95% Confidence Level
(Niveau de confiance 95 %) et Standard Error of Prediction (Erreur-type de prédiction).
3.
Cliquer avec le bouton droit sur la courbe standard et sélectionner Auto Scale (Echelle automatique) dans le menu contextuel. Quatre lignes supplémentaires s'affichent sur le graphique comme illustré ci-dessous.
Courbe standard
Conc. (mg/l) y = 0,11246 x + 3,38095
Coefficient de corrélation r2 = 0,39964
Ecart résiduel standard = 5,48836
3.5.5 Etape 5 - Effectuer une Transformation Réversible sur les Données
L'opération de manipulation est appliquée au fichier Photo1.pho utilisé à l'étape précédente pour créer une colonne dans le tableau échantillon.
1.
Cliquer sur le tableau échantillon pour l'activer.
2.
Sélectionner Operations (Opérations) > Manipulate (Manipuler).
3.
Cliquer sur l'onglet Transforms (Transformations).
4.
Dans la zone Source Column (Colonne source), sélectionner WL550 (LO550).
5.
Sélectionner 1/Y dans la zone Operators (Opérateurs), puis cliquer sur Add (Ajouter).
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Formation UVProbe 3-21
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.5 Exercice 2 - Opérations Photométriques de Base
6.
Cliquer sur Close (Fermer). Le résultat est calculé et placé dans la colonne TRANSFORM_1 du tableau échantillon.
7.
Sélectionner File (Fichier) > Save (Enregistrer).
REMARQUE
Lorsque le nom complet de la colonne n'est pas visible, agrandir l'en-tête de la colonne.
Consulter l'aide en ligne pour plus d'informations.
3-22 Formation UVProbe
3.6
3.6
Exercice 3 - Techniques Photométriques
Avancées
Dans cet exercice :
• Créer des équations personnalisées
• Acquérir des données avec un sipper
<Partie 1 - Equations Personnalisées>
Une analyse des acides du houblon est maintenant effectuée sur un échantillon de CO
2
pour analyser les composants acides du houblon dans la bière et d'autres boissons associées, c.-à-d. les acides alpha. Cette procédure est utilisée pour mieux comprendre la création d'équations personnalisées à l'aide d'une méthode de collecte de données. Lorsque les équations personnalisées ne sont pas utilisées, ignorer cette étape.
REMARQUE
Pour cette partie de l'exercice, les données sont entrées manuellement et non à l'aide d'un instrument.
Les équations personnalisées et les facteurs utilisés dans cet exercice se basent sur l'énoncé suivant :
Facteur de dilution (Dil) = vol dil A (l) * vol dil B (ml) * vol dil C (ml)
Poids échantillon (mg) * aliquote dil A (ml) * aliquote dil B (ml) où
A [VA]
B [VB]
C [VC]
= Volume total de l'échantillon initial
= Volume total de la première dilution
= Volume total de la seconde dilution
Poids échantillon [SW] mg = Poids de l'échantillon en mg
Aliquote dilA [ALQA] ml = Aliquote de A en ml
Aliquote dilB [ALQB] ml = Aliquote de B en ml
Les éléments alpha mg/l, bêta mg/l et fonds mg/l utilisent les équations suivantes.
Acides alpha (mg/l) [Acides A] = ((-51,56*WL1)+(73,79*WL2)–(19,07*WL3))
Acides bêta (mg/l) [Acides B] = ((55,57*WL1)–(47,59*WL2)+(5,10*WL3))
Fond (mg/l) [Fd] = ((8,34*WL1)–(15,74*WL2)+(37,19*WL3))
Calculer la concentration final comme suit :
% acides alpha (mg/l) [%acides A] = Aacids*Dil*100
% acides bêta (mg/l) [%acides B] = Bacids*Dil*100
% fond (mg/l) [%Fd] = Bkg*Dil*100
Indice de stockage du houblon [HIS] = WL3/WL2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Formation UVProbe 3-23
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
3.6.1 Etape 1 - Créer une Méthode de Collecte de Données à l'aide d'Equations Personnalisées
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau) pour effacer le tableau échantillon existant.
2.
Utiliser le menu View (Affichage) pour masquer le tableau standard, la courbe standard et le graphique échantillon, car ils ne sont pas utilisés dans cet exercice. L'écran doit ressembler à la figure suivante.
3.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode) ou cliquer sur l'icône Method (Méthode).
4.
Entrer 350 dans la zone Wavelength (nm) (Longueur d'onde (nm)).
5.
Sélectionner WL1 (LO1) dans la zone Column Name (Nom de la colonne), puis cliquer sur Add
(Ajouter). Une colonne appelée WL1 (LO1) s'ajoute à la liste Entries (Entrées) (le nom de la colonne est modifié pour réduire la largeur, car le tableau comporte beaucoup de colonnes).
6.
Entrer 325 dans la zone Wavelength (Longueur d'onde), puis sélectionner WL2 (LO2) dans la zone Column Name (Nom de la colonne). Cliquer sur Add (Ajouter).
7.
Entrer 275 dans la zone Wavelength (Longueur d'onde), puis sélectionner WL3 (LO3) dans la zone Column Name (Nom de la colonne). Cliquer sur Add (Ajouter). L'écran doit ressembler à la figure suivante.
3
3-24
8.
Cliquer sur le bouton Next (Suivant) pour ouvrir la page Calibration Curve (Courbe d'étalonnage).
9.
Sélectionner Photometric Measurement (Mesure photométrique) dans la zone Calibration
Method (Méthode d'étalonnage).
Formation UVProbe
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
10. Cliquer sur le bouton Next (Suivant) et ouvrir la page Measurement Parameter (Unknown sample) (Paramètre de mesure (Echantillon inconnu)) pour le tableau échantillon.
11. Sélectionner Manual (Manuel) comme méthode d'acquisition des données.
12. Cliquer sur le bouton Next (Suivant) pour ouvrir la page File Properties (Propriétés du fichier).
13. Entrer AcideHoublon dans la zone File Name (Nom du fichier). Il n'est pas nécessaire d'entrer l'extension du fichier.
14. Lorsqu'un titre ou un commentaire est ajouté aux données de mesure à titre indicatif, les entrer respectivement dans les boîtes de dialogue Title (Titre) et Comment (Commentaire). Il convient toutefois de les laisser vierges dans ce cas.
15. Cliquer sur le bouton Finish (Terminer).
Ajouter un facteur
1.
Cliquer sur l'onglet Equations, puis sur le bouton Factors (Facteurs).
2.
Entrer VA comme nom de colonne et cliquer sur Add (Ajouter). Comme les noms de colonne sont sensibles à la casse, il convient d'entrer des lettres majuscules.
3.
Répéter l'étape 2 avec les noms de colonne suivants : VB, VC, SW, ALQA, ALQB. L'écran doit ressembler à la figure suivante.
4.
Cliquer sur Close (Fermer) et laisser l'onglet Equation actif.
Créer une équation personnalisée
1.
Dans la liste Type de la page Equations, sélectionner Custom (Personnaliser) pour entrer une
équation personnalisée.
2.
Entrer Dil comme nom de colonne.
3.
Dans la zone Equation, entrer : ((VA*VB*VC)/(SW*ALQA*ALQB)). Vérifier l'absence d'espaces dans l'équation. Aucun espace entre les caractères n'est autorisé dans les équations.
REMARQUE
Il est également possible de double-cliquer sur les noms de colonnes et les opérateurs pour créer une équation.
4.
Cliquer sur Add (Ajouter) pour ajouter la colonne Dil au tableau.
5.
Entrer les équations suivantes à l'aide de la procédure ci-dessus.
Nom
Aacids (Acides A)
Bacids (Acides B)
Bkg (Fd)
%Aacids (%acides A)
%Bacids (%acides B)
%Bkg (%Fd)
((-51,56*WL1)+(73,79*WL2)–(19,07*WL3))
((55,57*WL1)–(47,59*WL2)+(5,10*WL3))
((8,34*WL1)–(15,74*WL2)+(37,19*WL3))
Aacids*Dil*100
Bacids*Dil*100
Bkg*Dil*100
Equation
Formation UVProbe 3-25
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
L'écran doit ressembler à la figure suivante.
6.
Dans la liste Type, sélectionner Ratio (Coefficient).
7.
Entrer HSI comme nom de colonne.
8.
Dans la zone Columns (Colonnes), double-cliquer sur WL3 (LO3).
9.
Dans la zone Columns (Colonnes), double-cliquer sur WL2 (LO2).
10. Cliquer sur Add (Ajouter), puis sur Close (Fermer).
3-26 Formation UVProbe
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
3.6.2 Etape 2 - Sauvegarder une Méthode de Collecte de Données
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous).
2.
Dans la zone File Name (Nom du fichier), entrer AcideHoublon.
3.
Dans la liste Save As Type (Type de fichier), cliquer sur Methods (Méthodes) (*.pmd).
4.
Cliquer sur Save (Enregistrer).
3.6.3 Etape 3 - Compléter le Tableau Echantillon
Une fois le tableau créé et ses colonnes définies, compléter le tableau avec des valeurs de facteur.
1.
Entrer Exemple1 pour le premier ID échantillon dans le tableau échantillon.
2.
Entrer les facteurs suivants dans le tableau échantillon :
Colonne
VA
VB
VC
SW
ALQA
ALQB
Valeur
0,01
50
25
166,5
1
2
3.
Entrer les valeurs suivantes dans les colonnes de longueur d'onde. Les résultats de lecture d'un instrument s'affichent généralement dans ces colonnes.
Colonne
WL1 (LO1)
WL2 (LO2)
WL3 (LO3)
Valeur
0,833
0,833
0,195
Sauvegarder le fichier
REMARQUE
Comme le nom du fichier est défini lors du chargement du tableau standard, le fichier est
écrasé pendant la sauvegarde.
1.
Sélectionner File (Fichier) > Overwrite (Ecraser).
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Formation UVProbe 3-27
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
3.6.4 Etape 4 - Vérifier les Résultats de Calcul
1.
Comparer les résultats affichés ci-dessous avec ceux du tableau échantillon pour les vérifier.
Colonne
Dil
Aacids (Acides A)
Bacids (Acides B)
Bkg (Fd)
%Aacids (%acides A)
%Bacids (%acides B)
%Bkg (%Fd)
HSI
Résultat
0,038
14,80
7,64
1,09
55,56
28,68
4,09
0,234
2.
Si les résultats sont différents, double-cliquer sur les données entrées et vérifier que les
équations sont correctes.
REMARQUE
Les résultats peuvent varier en fonction des paramètres différents des décimales. Consulter l'aide en ligne pour plus d'informations.
3.6.5 Etape 5 - Afficher/Masquer des Colonnes
Les colonnes inutiles sont masquées. Certains calculs sont des étapes intermédiaires ; ces colonnes ne doivent donc pas être affichées.
Masquer des colonnes
1.
Cliquer avec le bouton droit sur le tableau échantillon et sélectionner Properties (Propriétés) dans le menu contextuel.
2.
Afficher au premier plan la page Properties (Propriétés) et cliquer sur l'onglet Columns (Colonnes).
3.
Dans la liste Columns (Colonnes), cliquer sur Aacids (Acides A), puis sur Hide (Masquer). La colonne Aacids (Acides A) est maintenant masquée, comme illustré dans le tableau ci-dessous.
3
3-28
4.
Masquer les colonnes Bacids (Acides B) et Bkg (Fd) en utilisant l'étape ci-dessus.
REMARQUE
Il est possible de double-cliquer sur le nom de la colonne pour afficher ou masquer la colonne.
Formation UVProbe
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
<Partie 2 - Utiliser unSipper pour Collecter des Données>
Un sipper est maintenant installé et utilisé pour collecter des données inconnues. Lorsqu'un sipper n'est pas disponible, ignorer cette section.
Avant de commencer, préparer trois échantillons inconnus à mesurer.
Dans cet exercice :
• Installer un sipper
• Charger un fichier photométrique
• Modifier la méthode de collecte de données
• Collecter des données inconnues
3.6.6 Etape 1 - Installer un Sipper
1.
Sélectionner File (Fichier) > New (Nouveau).
2.
Installer le sipper dans le compartiment échantillon standard en retirant ce dernier et en mettant soigneusement le sipper en place. Pour plus d'informations, consulter le manuel d'instructions.
3.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode).
4.
L'assistant de la méthode photométrique démarre. Cliquer sur le bouton Next (Suivant) pour lancer l'assistant, puis sur le bouton Finish (Terminer). Il n'est pas nécessaire de modifier les paramètres.
5.
Cliquer sur l'onglet Instrument Parameters (Paramètres de l'instrument), puis sélectionner la valeur la plus élevée pour la largeur de la fente. Plus la fente est large, plus le trajet lumineux est long.
6.
Couvrir les détecteurs avec un carte de visite ou du papier épais.
7.
Sélectionner Instrument > Configure (Configurer) > onglet Maintenance.
REMARQUE
L'onglet Maintenance n'est activé qu'en cas de connexion à un instrument.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
8.
Cocher la case Set Zero Order Light (Définir la lumière blanche sur zéro).
9.
Cliquer sur OK si les détecteurs sont couverts.
REMARQUE
La fonction de mise à zéro de la lumière blanche n'est pas disponible sur tous les instruments.
Elle est caractérisée par un affichage estompé. Lorsque cette fonction n'est pas disponible, définir la longueur d'onde sur 540 nm à l'aide du bouton GoToWL (Aller à LO) pour remplacer les étapes 7, 8 et 9 ci-dessus.
Formation UVProbe 3-29
3.6 Exercice 3 - Techniques Photométriques Avancées
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
10. Vérifier que le faisceau lumineux traverse le centre de l'ouverture de la cuve du sipper.
11. Cliquer sur OK lorsque l'alignement est terminé. La fonction de mise à zéro de la lumière blanche n'est pas activée lorsque la boîte de dialogue se ferme.
REMARQUE
Lorsque la cuve du sipper doit être alignée, régler les grandes vis situées à l'avant de la cuve.
Déplacer la cuve jusqu'à ce que le faisceau frappe uniformément l'ouverture.
3.6.7 Etape 2 - Modifier une Méthode de Collecte de Données pour Utiliser le Sipper
1.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir). Sélectionner Photometric (Photométrique) comme type de fichier.
2.
Ouvrir le fichier Photo1.pho.
3.
Cliquer sur Connect (Connecter) sur la barre de boutons du photomètre si l'instrument n'est pas connecté.
4.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode) ou cliquer sur l'icône Method (Méthode).
5.
Cliquer sur l'onglet Attachments (Accessoires).
6.
Sélectionner Sipper/TSU ou Syringe Sipper (Sipper à seringue) dans la liste des accessoires.
7.
Laisser tous les paramètres sur leur valeur par défaut, puis cliquer sur Close (Fermer).
3.6.8 Etape 3 - Collecter les Données Inconnues
Remettre le sipper à zéro
1.
Avec de l'eau, vérifier les délais d'aspiration et d'inactivité en cliquant sur Sip (Aspiration) sur la barre de boutons du photomètre. Vérifier l'absence de bulles.
2.
Cliquer sur le bouton Auto Zero (Remise à zéro) pour remettre l'instrument à zéro en utilisant l'eau présente dans la cuve à circulation.
3.
Cliquer sur le tableau échantillon pour l'activer.
4.
Entrer trois ID échantillon dans le tableau : Echantillon1, Echantillon2, Echantillon3.
5.
Maintenir le conteneur d'un échantillon inconnu à hauteur du tube du sipper. Appuyer sur le levier du sipper pour effectuer une lecture (une pression sur le bouton Read Unk (Lire inc.) n'active pas le sipper).
Répéter l'étape 5 pour les deux derniers échantillons.
REMARQUE
Lorsque la boîte de dialogue Method Properties (Propriétés de la méthode) se ferme, la méthode photométrique ne modifie pas le paramètre de longueur d'onde du monochromateur.
Utiliser le bouton
λ Go to WL (Aller à LO) pour déplacer le monochromateur vers une longueur d'onde spécifique qui doit être utilisée pour la fonction de remise à zéro.
La leçon relative au module photométrique est terminée.
3-30 Formation UVProbe
4 Le Module Cinétique, Leçon 3
Chapitre 4 Le Module
Cinétique, Leçon 3
Cette leçon présente le module cinétique qui contrôle l'unité du spectrophotomètre pour observer les changements temporels des échantillons en matière d'absorbance, de transmission, de réflectance ou d'énergie.
Le module est flexible et convivial. Il permet :
• de concevoir des méthodes élémentaires ou complexes de collecte de données ;
• de configurer plusieurs instruments et accessoires pour la collecte de données ;
• de sauvegarder des paramètres de collecte et d'afficher les données collectées sur des graphiques et des tableaux de différents types, notamment Michaelis-Menten ;
• de manipuler les données avec des fonctions comme l'impression de données et la désignation de pic, de sauvegarder les données et de les imprimer directement à partir du module.
Le module comporte quatre volets : Operation (Opération), Information (Informations), Time Course graph
(Graphique de décours temporel) et Enzyme graph (Graphique enzyme).
• Le volet Operation (Opération) s'affiche dans la section supérieure gauche et contient toutes les fonctions de manipulation et d'affichage des données (par ex., impression de données, surface des pics et désignation de pic). Il affiche également le tableau principal et le tableau d'activités.
• Le volet Information (Informations) se situe sous le volet Operation (Opération) et affiche les informations relatives à la méthode de collecte de données, ou le tableau d'événements ou un tableau de Michaelis-
Menten.
• Le volet Time Course graph (Graphique de décours temporel) se trouve dans la section supérieure droite et affiche l'évolution de la valeur (absorbance, transmission, réflectance ou énergie) de l'échantillon dans le temps. L'axe X affiche le temps, l'axe Y la valeur.
• Le volet Enzyme graph (Graphique enzyme) se situe sous le graphique de décours temporel et affiche les relations entre Michaelis-Menten, Hill, ou l'inhibiteur.
Cette leçon comporte les trois exercices suivants :
• Mesures de base
• Opérations cinétiques de base
• Techniques cinétiques avancées
TABLE DES MATIÈRES
4.1
Fenêtre Cinétique .............................................................................................................................. 4-2
4.2
Barre d'Outils Cinétique..................................................................................................................... 4-3
4.3
Exercice 1 - Mesures de Base........................................................................................................... 4-4
4.4
Exercice 2 - Opérations Cinétiques de Base..................................................................................... 4-7
4.5
Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées ............................................................................... 4-11
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Formation UVProbe 4-1
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4.1
4.1
Fenêtre Cinétique
Volet Operation (Opération) Barre d'outils cinétique
Volet Information
(Informations)
Volet Time Course Graph
(Graphique de décours temporel)
Volet Enzyme Graph (Graphique enzyme)
4-2 Formation UVProbe
4.2
4.2
Barre d'Outils Cinétique
View Time Course Graph (Afficher le graphique de décours temporel)
View Operation (Afficher l'opération)
View Information (Afficher les informations)
View Kinetics Graph (Afficher le graphique cinétique)
File Properties (Propriétés du fichier)
Settings (Paramètres)
Properties (Propriétés)
Method (Méthode)
Data Print
(Impression de données)
Manipulate (Manipuler)
Peak Pick
(Désignation de pic)
Main Table (Tableau principal)
Activity Table (Tableau d'activités)
Volet Method (Méthode)
Point Pick (Désignation de point)
Peak Area (Surface des pics)
Sewing Box (Couture)
Event Table (Tableau d'événements)
Enzyme
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Formation UVProbe 4-3
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4
4
4.3
4.3
Exercice 1 - Mesures de Base
Dans cet exercice :
• Créer une méthode de collecte de données
• Préparer un échantillon de poudre d'EDTA avec une solution de base d'eau déionisée
• Effectuer une lecture du décours temporel
Vérifier que l'instrument est connecté. Si un instrument n'a pas été ajouté ou configuré comme décrit dans l'introduction, exécuter cette opération maintenant. Se reporter à la page 1-31, Communication
avec le Spectrophotomètre.
4.3.1 Etape 1 - Créer une Méthode de Collecte de Données
Une méthode de collecte de données est créée pour mesurer l'échantillon de poudre pour l'absorbance à une longueur d'onde de 550 nm à l'aide du mode de temporisation automatique.
1.
Sélectionner Window (Fenêtre) > Kinetics (Cinétique) pour ouvrir le module correspondant.
2.
Sélectionner Edit (Edition) > Method (Méthode) ou cliquer sur l'icône Method (Méthode) pour afficher la boîte de dialogue correspondante.
3.
Sélectionner Manual (Manuel) pour le mode de temporisation pour calculer automatiquement la durée totale lorsque la durée du cycle et le nombre de lectures sont entrés. La zone Total time
(Durée totale) n'est plus active ; les zones Cycle Time (Durée du cycle) et Number of Readings
(Nombre de lectures) sont maintenant actives.
4
4.
Activer l'option Auto dans Timing Mode (Mode de temporisation) pour définir la durée totale de mesure et calculer automatiquement la durée du cycle et le nombre de lectures. Utiliser le mode automatique pour cet exercice.
5.
Entrer 120 pour la durée totale.
6.
Dans la zone Type sous Wavelengths (Longueurs d'onde) (nm), vérifier que Single wavelength
(Longueur d'onde unique) est sélectionné. Cela signifie que UVProbe effectue les lectures à une longueur d'onde uniquement.
7.
Entrer 550 dans la zone WL1 (LO1) pour mesurer l'échantillon à 550 nm. Laisser tous les autres paramètres par défaut.
8.
Cliquer sur l'onglet Instrument Parameters (Paramètres de l'instrument).
4-4 Formation UVProbe
4.3 Exercice 1 - Mesures de Base
9.
Sélectionner Absorbance dans la liste Measuring Mode (Mode de mesure).
10. Cliquer sur OK. La barre d'état du photomètre affiche "Slewing (Balayage rapide)", puis la valeur de la longueur d'onde en cours (550 nm).
4.3.2 Etape 2 - Préparer un Echantillon de Poudre
Au cours de cette étape, une petite quantité d'EDTA est mélangée à de l'eau déionisée pour préparer un échantillon de poudre. A ce stade de la procédure, remettre à zéro l'unité du photomètre à une longueur d'onde spécifiée et apporter de petites modifications, comme corriger l'écart en raison des effets thermiques. Dans ce cas, remettre à zéro l'instrument à 550 nm avec l'eau déionisée dans le compartiment échantillon.
1.
Placer une cuvette d'eau déionisée dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
2.
Vérifier que la longueur d'onde est définie sur 550 nm (utiliser le bouton
λ Go to WL (Aller à LO) pour cette opération). Cliquer sur Auto Zero (Remettre à zéro) sur la barre de boutons du photomètre ou appuyer sur la touche F6.
3.
Une fois la remise à zéro terminée, la lecture de l'absorbance dans la barre d'état du photomètre doit correspondre à zéro. Retirer la cuvette du compartiment échantillon.
4.
Ajouter une petite quantité d'EDTA dans la cuvette contenant l'eau déionisée.
5.
Agiter l'échantillon et le placer dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
6.
Veiller à ce que la valeur d'absorbance initiale soit proche de 1,5 sur la barre d'état du photomètre. Si la valeur d'absorbance est trop basse, ajouter de la solution d'EDTA. Si elle est trop élevée, diluer avec de l'eau déionisée.
4.3.3 Etape 3 - Effectuer une Lecture du Décours Temporel
L'absorbance de l'échantillon de poudre est mesurée en fonction de la méthode en cours et les données sont sauvegardées dans un fichier de décours temporel.
1.
Sur l'axe Y, cliquer sur la valeur d'absorbance minimale, puis la définir sur 0,0. Cliquer sur la valeur d'absorbance maximale et la définir sur 4,0.
Formation UVProbe 4-5
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4.3 Exercice 1 - Mesures de Base
2.
Agiter l'échantillon de poudre et le placer dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
3.
Cliquer sur Start (Démarrer) sur la barre de boutons du photomètre (ou sur la touche F9) pour effectuer la mesure du décours temporel. L'état du photomètre affiche l'absorbance mesurée à chaque intervalle de temps et les données en temps réel s'affichent sur le graphique de décours temporel superposé.
4.
Une fois la mesure effectuée, la boîte de dialogue New Data Set (Nouvel ensemble de données) s'affiche. Entrer EDTA comme nom de fichier.
5.
Entrer Test comme nom de stockage.
4
6.
Cliquer sur Finish (Terminer). Le graphique s'affiche automatiquement par défaut en mode Active
(Actif).
Sauvegarder les données de décours temporel
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save (Enregistrer).
2.
Sélectionner Time Course (Décours temporel) (*.kin) comme type de données dans la boîte de dialogue Select Active File (Sélectionner le fichier actif).
3.
Cliquer sur OK.
4-6 Formation UVProbe
4.4
4.4
Exercice 2 - Opérations Cinétiques de Base
Dans cet exercice :
• Effectuer une désignation de point et sauvegarder le modèle correspondant
• Effectuer une opération de blanc de cuve
• Collecter un second ensemble de données pour observer les effets de l'opération de blanc de cuve
• Ouvrir un modèle de désignation de point précédemment sauvegardé
• Modifier le tableau principal pour recalculer l'activité d'un ensemble de données
4.4.1 Etape 1 - Effectuer une Désignation de Point
Utiliser une désignation de point à intervalles de 30 secondes pour créer un tableau de désignation de point qui fournit des valeurs de données pour les durées sélectionnées. Rouvrir le fichier EDTA s'il a
été fermé au cours de l'exercice précédent.
1.
Sélectionner Operations (Opérations) > Point Pick (Désignation de point) et entrer les valeurs suivantes dans le tableau.
Durée (secondes)
10
30
60
90
120
Description
A
B
C
D
E
2.
Cliquer avec le bouton droit sur le tableau de désignation de point et sélectionner Properties
(Propriétés) dans le menu contextuel.
3.
Dans la liste Labels (Marques), cliquer sur Description (une coche indique que l'option est sélectionnée).
4.
Dans la liste Mark Style (Marquer le style), choisir un style.
5.
Cliquer de nouveau avec le bouton droit sur le tableau de désignation de point, cliquer sur Mark
Points (Marquer les points) et observer l'apparence des marques sur le graphique.
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4.4.2 Etape 2 - Sauvegarder le Tableau de Désignation de Point comme Modèle
Le tableau de désignation de point est sauvegardé comme modèle pour une utilisation ultérieure dans cette leçon. Un modèle de désignation de point sauvegarde les entrées de durée et de description dans le tableau sans les valeurs d'absorbance. Une fois le modèle ouvert, UVProbe calcule de nouvelles valeurs basées sur l'ensemble de données actif.
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous).
2.
Vérifier que le répertoire Data (Données) est sélectionné dans la zone Save In (Enregistrer dans).
3.
Entrer Point1 comme nom de fichier, sélectionner le modèle de désignation de point (*.kpt) comme type de fichier et cliquer sur Save (Enregistrer).
Formation UVProbe 4-7
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4.4 Exercice 2 - Opérations Cinétiques de Base
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4.4.3 Etape 3 - Effectuer une Opération de Blanc de Cuve
Il convient d'effectuer maintenant une opération de blanc de cuve. Si l'utilisateur clique sur Cell Blank
(Blanc de cuve) sur la barre de boutons du photomètre, le spectrophotomètre effectue une lecture et la soustrait de toutes les lectures suivantes lors de l'acquisition de données. L'opération de blanc de cuve vise à éliminer l'effet de la cuvette des résultats. La lecture de blanc de cuve est valide jusqu'à ce qu'une autre opération de blanc de cuve ou une remise à zéro soit effectuée.
REMARQUE
Veiller à ce que le spectrophotomètre soit connecté et que la barre de boutons du photomètre soit affichée. Une opération de blanc de cuve doit être effectuée avant de collecter les données.
1.
Placer une cuvette vide dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
2.
Cliquer sur le bouton Cell Blank (Blanc de cuve) ou sur la touche F5 pour afficher une boîte de dialogue avec les données correspondantes. Cliquer sur OK pour terminer l'opération de blanc de cuve.
4.4.4 Etape 4 - Collecter un Second Ensemble de Données
Un second ensemble de données est collecté et sauvegardé à l'aide de la méthode de collecte de données et des informations de l'exercice 1 de cette leçon. Etant donné que l'opération de blanc de cuve élimine l'effet de la cuvette sur les lectures, il existe une différence au niveau de l'absorbance même si la même méthode de collecte de données est utilisée sur le même échantillon.
REMARQUE
Si la méthode de collecte de données a été modifiée depuis le premier exercice de cette leçon, rétablir les paramètres utilisés dans l'exercice 1.
Collecter les données
1.
Agiter l'échantillon de poudre et le placer dans le compartiment échantillon du spectrophotomètre.
2.
Cliquer sur Start (Démarrer) sur la barre de boutons du photomètre. Les résultats des données en temps réel apparaissent sur le graphique de décours temporel superposé.
3.
Entrer EDTA2 comme nom de fichier dans la boîte de dialogue Save Data (Sauvegarder les données).
4.
Entrer Test2 comme nom de stockage de données.
5.
Cliquer sur Finish (Terminer). Il existe une différence entre cette lecture du graphique et la première. L'opération de blanc de cuve en est l'origine.
4-8
Sauvegarder les données
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save (Enregistrer).
Formation UVProbe
4.4 Exercice 2 - Opérations Cinétiques de Base
2.
Sélectionner Time Course (Décours temporel) (*.kin) comme type de données dans la boîte de dialogue Select Active File (Sélectionner le fichier actif), puis cliquer sur OK.
4.4.5 Etape 5 - Ouvrir un Modèle de Désignation de Point Précédemment
Sauvegardé
Le modèle de désignation de point sauvegardé à l'exercice 1 est ouvert pour être utilisé avec le fichier
EDTA2.
1.
Sélectionner Operations (Opérations) > Point Pick (Désignation de point) pour afficher un tableau vierge.
2.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir).
3.
Pour le type de fichier, sélectionner le modèle de désignation de point (*.kpt).
4.
Double-cliquer sur Point1.kpt.
REMARQUE
La souris peut être positionnée sur le numéro des onglets d'index en-dessous du tableau de désignation de point pour afficher le nom de l'ensemble de données.
Le tableau de désignation de point contient maintenant les valeurs de durée et de description sauvegardées et la colonne d'absorbance contient les nouvelles données extraites de l'ensemble de données actif.
4.4.6 Etape 6 - Modifier le Tableau Principal
Les fichiers non utilisés sont supprimés de la mémoire et le tableau principal est modifié en masquant les colonnes pour disposer de plus d'espace sur l'écran. Puis, les valeurs de début et de fin sont modifiées et le facteur changé pour recalculer l'activité d'un ensemble de données.
Supprimer des fichiers de la mémoire
1.
Sélectionner File (Fichier) > Properties (Propriétés).
2.
Dans la boîte de dialogue File Properties (Propriétés du fichier), cliquer sur chaque fichier successivement, puis sur Delete (Supprimer).
3.
Cliquer sur Close (Fermer) après avoir supprimé tous les fichiers de la mémoire.
Masquer des colonnes du tableau principal
1.
Sélectionner File (Fichier) > Open (Ouvrir).
2.
Dans la zone Files of Type (Type de fichier), sélectionner les fichiers de décours temporel.
3.
Dans le répertoire Data (Données), sélectionner Achn00.tmc, Achn01.tmc, Achn02.tmc et
Achn03.tmc (maintenir la touche Maj enfoncée et cliquer sur les fichiers pour les sélectionner).
Cliquer sur Open (Ouvrir).
4.
Sélectionner Operations (Opérations) > Main Table (Tableau principal).
5.
Cliquer avec le bouton droit sur le tableau principal et sélectionner Properties (Propriétés) dans le menu contextuel.
6.
Sur la page Properties (Propriétés), double-cliquer sur les colonnes suivantes pour les masquer :
Sample ID (ID échantillon), Wavelength (Longueur d'onde), Initial Reading (Lecture initiale), SD, mAbs/
Min, Comments (Commentaires). Vérifier que les colonnes suivantes sont affichées : G, R, Activity
(Activité), Start (Début), End (Fin), Factor (Facteur) et Correction Factor (Facteur de correction).
7.
Cliquer sur la page Properties (Propriétés) pour la fermer. Ne pas cliquer sur Reset (Réinitialiser), sinon les paramètres d'origine réapparaîtront.
Recalculer la valeur d'activité d'un ensemble de données
1.
Cocher les cases de la colonne R pour afficher la zone d'activité d'un ensemble de données qui apparaît sous la forme d'une ligne en pointillés sur le graphique.
2.
Dans le tableau, définir la valeur de début sur 200 et la valeur de fin sur 600 pour les quatre fichiers de données. La valeur d'activité est recalculée et la zone sur le graphique est mise à jour.
Les valeurs de début et de fin peuvent également être modifiées à l'aide des barres de lecture lorsqu'il s'agit du volet graphique Active (Actif).
3.
Définir les facteurs sur 1, 4,5, 9 et 11 et appuyer sur Entrée. Les modifications des valeurs d'activité du tableau sont appliquées.
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4.4 Exercice 2 - Opérations Cinétiques de Base
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Sauvegarder les données
1.
Sélectionner File (Fichier) > Save As (Enregistrer sous) pour afficher la boîte de dialogue Save
Kinetics File (Sauvegarder le fichier cinétique).
2.
Cliquer sur le bouton Select (Sélectionner) pour afficher la boîte de dialogue Data Set Selection
(Sélection de l'ensemble de données) et sélectionner un fichier (il n'est possible de sélectionner qu'un seul fichier à la fois. L'ordre des fichiers étant alphabétique, il peut changer lorsque les fichiers sont renommés. Veiller à lire les noms de fichiers).
3.
Entrer Cinétique1 pour le nom de fichier et cliquer sur Save (Enregistrer).
4.
Répéter les étapes 1 à 3 pour sauvegarder les autres fichiers et utiliser respectivement les noms de fichiers Cinétique2, Cinétique3 et Cinétique4.
REMARQUE
Il existe deux moyens d'afficher le paramètre de l'ensemble de données.
1. Ouvrir la boîte de dialogue File Properties (Propriétés du fichier) et sélectionner l'icône Data
Set (Ensemble de données). Le paramètre s'affiche dans l'onglet Method (Méthode).
2. Dans la fenêtre Legend (Légende), double-cliquer sur l'ensemble de données. Le paramètre s'affiche dans le volet Information (Informations).
4-10 Formation UVProbe
4.5
4.5
Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées
Dans cet exercice :
• Calculer une équation de Michaelis-Menten
• Configurer le graphique cinétique personnalisé
• Créer un tableau d'inhibiteur à l'aide des valeurs du tableau de Michaelis-Menten
• Acquérir des données avec un passeur de cuves
4.5.1 Etape 1 - Calculer une Equation de Michaelis-Menten
Un tableau de Michaelis-Menten est créé et contient des valeurs pour calculer les constantes Km et
Vmax à l'aide de quatre fichiers de décours temporel échantillon.
Avant de commencer, veiller à ce que les fichiers Cinétique1, Cinétique2, Cinétique3 et Cinétique4 soient ouverts.
Le tableau de Michaelis-Menten contient la concentration de substrat et les vitesses nécessaires pour calculer les constantes Km et Vmax pour une expérimentation particulière en utilisant l'équation de
Michaelis-Menten. Celle-ci permet de calculer les valeurs de Km (constante de Michaelis) et Vmax basées sur le type de transformation sélectionné.
• Km est la concentration de substrat où la vitesse initiale correspond à la moitié de la variation maximale possible dans les conditions de l'expérimentation.
• Vmax est la vitesse initiale maximale.
La valeur de Km reflète la stabilité de l'interaction de substrat enzymatique. Toutefois, l'utilisation d'une forme linéaire de l'équation de Michaelis-Mente, telle que la représentation de Lineweaver-Burk ou de Hanes, permet un calcul plus précis de la constante Km. Utiliser le tableau de Michaelis-Menten pour permuter rapidement entre les quatre types de transformations et observer les modifications des constantes Km et Vmax.
Créer un tableau de Michaelis-Menten
REMARQUE
Si aucun fichier n'est ouvert, le tableau principal n'est pas disponible dans le menu.
1.
Sélectionner Operations (Opérations) > Main Table (Tableau principal).
2.
Sélectionner Operations (Opérations)> Enzyme Table (Tableau enzyme) pour afficher les informations du tableau de Michaelis-Menten dans le volet Information (Informations).
3.
Cliquer avec le bouton droit sur le volet Information (Informations), puis cliquer sur New
(Nouveau) dans le menu contextuel pour afficher la boîte de dialogue New Dataset Information
(Informations sur le nouvel ensemble de données) et commencer à créer un tableau de
Michaelis-Menten.
4.
Entrer MM1 pour le nom de fichier, Cinétique pour le stockage et Ensembledonnées1 pour l'ensemble de données.
5.
Cliquer sur Finish (Terminer) pour créer le tableau de Michaelis-Menten vierge.
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4.5 Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées
REMARQUE
Pour afficher un autre type de tableau enzyme, sélectionner Inhibitor (Inhibiteur) ou Hill dans le menu contextuel pour modifier le type de tableau actif.
Compléter le tableau de Michaelis-Menten à l'aide du bouton Load (Charger)
1.
Dans le tableau de Michaelis-Menten, cliquer sur le bouton Load (Charger) dans la colonne File
(Fichier).
REMARQUE
Il est également possible de glisser-déplacer des fichiers de données du tableau principal vers le tableau de Michaelis-Menten. Consulter l'aide en ligne pour des instructions.
2.
Dans la boîte de dialogue Select Activity Data Set (Sélectionner l'ensemble de données d'activité), développer l'arborescence du fichier Cinétique1 jusqu'à l'ensemble RawData (Données brutes).
REMARQUE
Si le nom de fichier n'apparaît pas en entier, agrandir la boîte de dialogue en cliquant sur l'angle inférieur droit.
3.
Cliquer sur l'ensemble RawData (Données brutes) associé au fichier Cinétique1, puis sur OK.
4.
Charger les ensembles de données associés aux fichiers Cinétique2, Cinétique3 et Cinétique4 de la même manière.
5.
Modifier la concentration de substrat (colonne [S]) du tableau de Michaelis-Menten en indiquant respectivement les valeurs 0,3, 3,0, 15,0 et 45,0.
REMARQUE
Il est également possible d'entrer la concentration de substrat dans la boîte de dialogue Select
Activity Data (Sélectionner l'ensemble de données d'activité) illustrée ci-dessus.
6.
Les valeurs Km et Vmax au bas du tableau sont calculées.
4-12 Formation UVProbe
4.5 Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées
4.5.2 Etape 2 - Configurer un Graphique Cinétique Personnalisé
Le volet Enzyme graph (Graphique enzyme) est personnalisé pour afficher les données du tableau en cours avec chacun des types de transformations linéaires : Lineweaver-Burk, Hanes, Woolf et Eadie-
Hofstee.
1.
Cliquer sur l'onglet Custom (Personnalisé) du volet Enzyme graph (Graphique enzyme).
2.
Cliquer avec le bouton droit sur le graphique, puis sélectionner Customize (Personnaliser) dans le menu contextuel.
3.
Cliquer sur l'onglet Custom graph (Graphique personnalisé) dans la boîte de dialogue Graph
Properties (Propriétés du graphique).
4.
Vérifier que le type de données correspond à Michaelis-Menten.
5.
Dans la liste Type of Transformation (Type de transformation), cliquer sur Hanes, puis sur Add
(Ajouter). Répéter le processus en utilisant Woolf et Eadie-Hofstee figurant dans cette même liste.
6.
Vérifier que l'orientation sélectionnée est Tiled (Mosaïque), puis cliquer sur OK.
7.
Sélectionner chaque graphique successivement dans le volet Enzyme graph (Graphique enzyme), cliquer avec le bouton droit et sélectionner Auto Scale (Echelle automatique) dans le menu contextuel pour afficher un volet graphique ressemblant à la figure suivante, avec un graphique pour chaque type de transformation.
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4.5 Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées
Transformation d'axe dans le graphique de Michaelis-Menten
1.
Cliquer avec le bouton droit sur un volet du graphique d'activité enzyme pour afficher le menu contextuel. Sélectionner "Customize (Personnaliser)" dans le menu.
2.
Cliquer sur l'onglet "Axis (Axe)" de la boîte de dialogue "Customize Graph (Personnaliser le graphique)".
3.
Sélectionner "Original" dans la liste "Type of axis (Type d'axe)". Cocher la case "Show Enzyme
Information on the graph. (Afficher les informations enzymes sur le graphique)". Cliquer sur le bouton [OK].
4.
Les axes X et Y du volet graphique sont convertis respectivement de "1/V" à "V" et de "1/[S]" à
"[S]". Double-cliquer ou cliquer avec le bouton droit sur le graphique pour afficher le menu contextuel. Puis, sélectionner "Auto Scale (Echelle automatique)" pour ajuster l'échelle du graphique.
La valeur
V max s'affiche.
4
La valeur
K m s'affiche.
4-14 Formation UVProbe
4.5 Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées
4.5.3 Etape 3 - Créer et Compléter un Tableau d'Inhibiteur
Un tableau d'inhibiteur est créé à l'aide des valeurs Km et Vmax du tableau de Michaelis-Menten. Un tableau d'inhibiteur ressemble à un tableau de Michaelis-Menten et contient une colonne [I]
(Inhibiteur) au lieu d'une colonne [S] (Substrat). Il est possible d'appliquer une concentration de substrat différente pour modifier la valeur Ki.
Créer un tableau d'inhibiteur
1.
Cliquer avec le bouton droit sur le tableau de Michaelis-Menten et sélectionner Inhibitor
(Inhibiteur) dans le menu contextuel.
2.
Cliquer de nouveau avec le bouton droit sur le tableau de Michaelis-Menten, sélectionner New
(Nouveau) pour afficher la boîte de dialogue New Data Set Information (Informations sur le nouvel ensemble de données) et commencer à créer un tableau d'inhibiteur vierge.
3.
Entrer MM2 pour le nom de fichier, Cinétique pour le stockage et Ensembledonnées2 pour l'ensemble de données et cliquer sur Next (Suivant).
4.
Sélectionner les valeurs Km et Vmax du tableau de Michaelis-Menten. Cliquer sur en regard de MM1 et Cinétique, puis sur Ensembledonnées1.
REMARQUE
Pour entrer manuellement les valeurs Km et Vmax, sélectionner Edit Km and Vmax (Editer
Km et Vmax) dans la liste Source en haut de la boîte de dialogue.
5.
Cliquer sur Hanes sous Transformation, puis sur Next (Suivant). Lorsque la boîte de dialogue Set
Common Substrate Concentration (Définir la concentration de substrat commune) s'affiche, cliquer sur Finish (Terminer) pour accepter la valeur par défaut et afficher un tableau d'inhibiteur vierge, comme illustré ci-dessous.
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6.
Cliquer sur l'onglet Overlay (Superposé) dans le volet Enzyme graph (Graphique enzyme) pour afficher le graphique Dixon.
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4.5 Exercice 3 - Techniques Cinétiques Avancées
Compléter un tableau d'inhibiteur
1.
Dans le tableau d'inhibiteur, cliquer sur le bouton Load (Charger).
REMARQUE
Il est également possible de glisser-déplacer des fichiers de données du tableau principal vers le tableau d'inhibiteur. Consulter l'aide en ligne pour des instructions.
2.
Dans la boîte de dialogue Select Activity Data Set (Sélectionner l'ensemble de données d'activité), développer le fichier Cinétique1 jusqu'à l'ensemble RawData (Données brutes).
3.
Cliquer sur l'ensemble RawData (Données brutes) associé à Cinétique1.
4.
Cliquer sur OK.
5.
Charger les ensembles de données associés aux fichiers Cinétique2, Cinétique3 et Cinétique4 de la même manière.
6.
Modifier la concentration de l'inhibiteur (colonne [I]) pour chaque ensemble de données en indiquant les valeurs 0,3, 3,0, 13,0 et 45,0. Le tableau doit ressembler à la figure suivante.
4
4-16
7.
Dans la zone Method (Méthode), définir la méthode sur Hanes. Noter la modification de la valeur
KI.
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