NOTICE D’UTILISATION PrioWESTERN BSE Kit Test pour la détection in vitro de PrPSc liée aux EST Référence Catalogue PR12000 Pub. Nº MAN0013787 Rév. A.0 Au sein de l'Union Européenne, ce test est approuvé comme test rapide pour le programme de test de l'ESB chez les bovins mis en place conformément au Règlement (CE) No 999/2001. AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les producteurs de tests rapides d’EST doivent avoir mis en place un système d’assurance qualité, reconnu par le Laboratoire de Référence de l’Union Européenne (LRUE), qui garantisse que les performances du test ne varient pas. Des modifications concernant les outils d’échantillonnage ainsi que du test rapide lui-même ou du protocole du test (y compris l’échantillonnage) peuvent seulement être apportées après notification préalable au Laboratoire de Référence de l’Union Européenne (LRUE) et ne seront accordées qu’à condition que l’LRUE ait constaté que les modifications ne réduisent pas la sensibilité, la spécificité ou la fiabilité du test rapide. Après accord de l’LRUE, les détails de la modification doivent être communiqués à la Commission et aux Laboratoires Nationaux de Référence de l’Union Européenne. Introduction Divers tissus d'un animal infecté par les prions contiennent une variante pathologique, spécifique de la maladie, de la protéine prion normale (PrP). La protéine prion modifiée est appelée PrPSc. L'isoforme normale de la PrP est appelée PrPC (forme cellulaire de la PrP). La PrPSc se distingue de la PrPC normale par sa résistance aux protéases. Lors d'un traitement à la protéinase K, la PrPC est dégradée, tandis que la PrP Sc voit sa taille diminuer de 32–35 kD à 27–30 kD. Le fragment PrPSc résistant aux protéases est appelé PrP27–30. Applied Biosystems™ PrioWESTERN BSE Kit doit sa précision et sa fiabilité élevées au fait qu'il vérifie trois paramètres importants : résistance aux protéases, patron de glycosylation et poids moléculaire plus bas du fragment PrPSc résistant aux protéases (27–30 kD) par rapport à la PrP normale non digérée. Les propriétés uniques des solutions tampons utilisées dans le PrioWESTERN BSE Kit et la haute affinité de l'anticorps permettent d'effectuer le test directement sur des homogénats de tissu et d'associer la fiabilité du Western blot à la rapidité requise pour un dépistage sur un grand nombre d'échantillons. PrioWESTERN BSE Kit fut le premier kit de détection de l'ESB approuvé par les autorités suisses en 1998. En 1999, il fut officiellement validé par l'UE comme le seul test à démontrer 100% de sensibilité et 100% de spécificité sans répétition. Dans l'étude réalisée par le CRL (Laboratoire Central de Référence) en 2009 et portant sur la sensibilité analytique, il a été conclu que PrioWESTERN BSE Kit avait une performance 100 fois supérieure au système de test le plus sensible. Les données de validation de ce kit ont été certifiés par l'OIE, basée sur la révision d'experts, pour les objectifs suivants : Prêt pour le diagnostic post-mortem de l'encéphalopathie spongiforme chez les bovins et pour les objectifs suivants : 1. Pour confirmer le diagnostic des cas suspects ou cliniques (inclut la confirmation d'un test de dépistage positif) ; 2. Pour estimer la prévalence de l'infection pour faciliter l'analyse des risques (les régimes de santé des enquêtes ou des troupeaux ou le contrôle des maladies, des enquêtes, par exemple, mise en œuvre des mesures de lutte contre les maladies) et d'aider à la démonstration de l'efficacité des politiques de contrôle ; 3. Pour confirmer un résultat de test non négatif obtenu lors de la surveillance active avec un type de test différent. Principe du test Après le prélèvement et l'enregistrement des échantillons, ceux-ci sont analysés avec le PrioWESTERN BSE Kit. PrioWESTERN BSE Kit suit un protocole en cinq étapes, consistant en une homogénéisation, une digestion par une protéase, une électrophorèse en gel, un transfert et une détection. Immunologique. Une personne peut analyser 100 échantillons (en double) en 6–8 heures. Les échantillons sont prélevés, enregistrés et un homogénat est préparé à partir d'un morceau de tissu cérébral bien défini. Un traitement à la protéinase K dégrade complètement la PrPC tandis que la PrP Sc est réduite à un fragment de 27–30 kD. La réaction protéolytique est arrêtée et la PrPSc est détectée par le test PrioWESTERN BSE Kit. Les homogénats digérés sont soumis à une électrophorèse en gel et à un Western blot. Les membranes sont incubées avec un anticorps monoclonal-possédant une haute affinité pour PrP-pour la détection de PrPSc résistant aux protéases. Le signal est visualisé au moyen du conjugué second anticorps-phosphatase alcaline (AP). Contenu du kit (Suite à la page suivante) Kit pour 100 échantillons (analyses en double). Tous les composants non ouverts ont une durée de conservation de 1 an après leur production s'ils sont conservés à 5±3°C. Voir l'étiquette du kit pour la date effective de péremption. Les stabilités des composants dilués, ouverts ou reconstitués sont indiquées ci-dessous. Composant Description 1 : Concentré de tampon d'homogénéisation (5x) Concentration 5x, diluer avant utilisation. Une bouteille contenant 200 mL d'un tampon d'homogénéisation concentré 5x. Préparer la solution d'homogénéisation d'utilisation diluée 1x en mélangeant 1 volume de tampon d'homogénéisation (5x) et 4 volumes d'eau ultrapure. Durée de conservation de la solution d'homogénéisation d'utilisation : 1 semaine à 5±3°C. 2 : Tampon de digestion (1x) (Couleur du bouchon : jaune) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 4 mL de tampon de digestion. 3 : Protéinase K (Couleur du bouchon : blanc) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 4 mL de protéinase K. 4 : Solution d'arrêt de la digestion (1x) (Couleur du bouchon : rouge) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 4 mL d'inhibiteur de protéinase K pour l'arrêt de son activité protéolytique. 5 : Echantillon de contrôle Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 200 µL d'un contrôle fonctionnel (PrPC normale) et de marqueurs de poids moléculaire (97/66/45/30/20/14 kD) inclus dans du tampon de charge. Mélanger avant l'emploi, par exemple en donnant un petit coup sur le tube. 6 : Tampon de charge (1x) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 25 mL de tampon de charge pour électrophorèse en gel SDS de polyacrylamide (PAGE). (Contient du 2-mercaptoéthanol. Les flacons ouverts dégagent une mauvaise odeur. Toutefois, même si 100 flacons sont ouverts simultanément dans une pièce normalement aérée, les concentrations dans l'air n'atteignent pas le taux d'exposition à l'environnement sur la place de travail de 0.65 mg/m3 défini par l'American Industrial Hygiene Association.) Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Composant Description 7 : Concentré de tampon de blocage PVDF (5x) 5x concentré, à diluer avant l'emploi. Un flacon contient 100 mL de tampon de blocage concentré qui bloque les sites non spécifiques. Diluer 100 mL de tampon de blocage avec de l'eau ultrapure dans un volume final de 0.5 litre. 8 : 1er anticorps 6H4 Un tube contenant 30 µL d'anticorps monoclonal anti-PrP (IgG1 anti-PrP de souris). A diluer à 1:5000 (au cas où du liquide reste collé aux parois ou au bouchon, le tube peut être centrifugé). 9 : 2ème anticorps-AP Un tube contenant 30 µL d'IgG-AP de chèvre anti-souris, un anticorps dirigé contre l'IgG de souris et conjugué à la phosphatase alcaline. A diluer à 1:5000 (au cas où du liquide reste collé aux parois ou au bouchon, le tube peut être centrifugé). 10 : Concentré de tampon de luminescence 10x concentré, à diluer avant l'emploi. Un flacon contient 27 mL de tampon concentré de luminescence. Diluer ce tampon avec de l'eau ultrapure dans un volume final de 270 mL avant l'emploi. Contenu supplémentaire du kit • Notice • Etiquettes pour solutions diluées Equipements additionnels nécessaires Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Les équipements en gras ont été homologués pour une utilisation avec le PrioWESTERN BSE Kit. L'utilisateur assume sa responsabilité s'il emploie d'autres équipements. Use Généralités Homogénéisation Description Equipement de laboratoire correspondant aux directives nationales de sécurité. • Eau ultrapure : au moins équivalente aux eaux de grade 3 comme défini par ISO 3696 :1987 (E) • Pipette monocanal (1–10 µL) • Pipette monocanal (10–100 µL) • Pipette monocanal (100–1000 µL) • Pipette monocanal (1–5 mL) • Pipette multicanaux (0.5–10 µL) • Pipette multicanaux (10–100 µL) • Embouts de pipette (tels que recommandés par le fabricant des pipettes) • Réservoirs à solution • Plateaux pour incubation • Tubes coniques de 15 mL • Tubes coniques de 50 mL • • • • • Outil de découpe et pincettes Balance Distributeur pour le tampon d'homogénéisation 1x Plaque à 96 puits de 1.2 mL (plaque matrice) PrioGENIZER™, appareil d’homogénéisation avec six racks et un plateau (Réf. PR10000) et flacons d’homogénéisation PrioCLIP™ (Réf. PR10010) ou Homogénéisateur FASTH/MediFASTH ou FASTH2 et flacon d’homogénéisation Prypcon (Syntec International) ou Omni Tissue Homogenizer (TH115, TH220) et Soft Tissue Omni Tip™ Plastic Homogenizing Probes (32750) (Omni International) Digestion par la protéase • Plaques à 96 puits (puits de 0.2 mL ; utilisées comme plaques de digestion) • Film adhésif • Incubateur pour plaques de microtitrage (montant jusqu'à 100°C au moins) Electrophorèse en gel • NuPAGE™ 12% Bis-Tris Protein Gels (17 puits) (Réf. NP0349BOX) • Solution tampon de migration pour NuPAGE™ MOPS/SDS (Réf. NP0001 ou NP000102) • Antioxydant pour NuPAGE™ (Réf. NP0005) Transfert Détection immunologique 2 • Membrane PVDF, Immobilon-P 0.45 µm (EMD Millipore) • Méthanol (approx. 98%) • Tampon de transfert (10x) : 30.28 g Tris base/ 144.13 g glycine/compléter à 1000 mL avec de l'eau ultrapure • Solution saline tampon Tris (TBS, pH 7.4) : 8 g NaCl/0.2 g KCl/3 g Tris base. Compléter à 1000 mL avec de l'eau ultrapure, ajuster le pH à 7.4 avec HCl • Solution saline tampon Tris avec Tween (TBST) : TBS avec 0.05% (v/v) Tween-20 • Ponceau S (20x) : 0.5% (w/v) Ponceau S/5% (v/v) acide acétique Diluer à 1x avec TBST avant l'emploi • Concentré CDP-Star (= substrat de la phosphatase alcaline) (12.5 mM ; Réf. T2310) ou Roche Diagnostics GmbH (25 mM) ou CDP-Star, prêt à l'emploi (0.25 mM; Réf. T2146) • Hyperfilm ECL Déroulement du test Mesures de précaution • Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte. • Le PrioWESTERN BSE Kit doit être utilisé dans les laboratoires agréés. • De plus, le PrioWESTERN BSE Kit ne peut être exécuté que par des personnes ayant une formation générale sur le travail avec les prions et ayant suivi en particulier une formation à l’utilisation du PrioWESTERN BSE Kit. • Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et tous les objets en contact avec les échantillons doivent être considérés comme potentiellement contaminés. Commentaires Pour obtenir des résultats optimaux avec le PrioWESTERN BSE Kit, il est recommandé de respecter les aspects suivants : • Respecter rigoureusement le mode opératoire. • Les embouts de pipettes doivent être remplacés pour chaque opération de pipetage. • Il est fortement recommandé d'utiliser des embouts-filtres pour les pipettes ou des pipettes distinctes pour les différentes étapes. En outre, la précision du volume de pipetage doit être contrôlée périodiquement. Les directives nationales s'appliquent. • Utiliser un réservoir distinct pour chaque réactif. • Les composants du kit ne doivent pas être utilisés au-delà de leur date de péremption ou si leur aspect a changé. • Il ne faut pas utiliser en combinaison des composants de kits provenant de lots ayant des numéros différents. • Les instruments servant à couper et les pinces qui seront réutilisés doivent être décontaminés selon les protocoles définies par les autorités nationales. • Lorsque le PrioGENIZER™ est utilisé pour l'homogénéisation, n'utiliser que le programme P0 PRIONICS TSE. Prélèvement d'échantillons et homogénéisation • Couper 0.45–0.70 g de tissu nerveux de la zone de préférence, du côté gauche ou du côté droit du tronc cérébral, par exemple avec un scalpel. Le prélèvement d'échantillons et les tests en laboratoire doivent respecter la Réglementation (CE) No 999/2001, chaptire C, qui renvoie, pour ce qui est de la récolte des échantillons, à la dernière édition de “Manual Standards for Diagnostic Test and Vaccines of the International Office of Epizootic Diseases (OIE)” stipulant que : “Le prélèvement de choix pour un test immunologique devrait se situer sur l'obex ou aussi près que possible de celui-ci mais ne devrait pas se trouver à plus de 1.5 cm devant l'obex”. La figure ci-dessous montre, encadrée en 4, la zone de prélèvement d'échantillons. Remarque : Après le prélèvement des échantillons, une semi-section complète du tronc cérébral avec une région de l'obex intacte doit rester disponible pour d'éventuels tests confirmatifs. (1) (2) (3) (4) Moelle épinière Cerveau Région de l'obex Zone à utiliser pour le PrioWESTERN BSE Kit (5) Zone à utiliser par le Centre de Référence de l'ESB Medulla oblongata L'échantillon est un morceau de tronc cérébral/moelle épinière cervicale d'une longueur approximative de 8 cm. Homogénéisation Préparation • Pour obtenir la solution d’utilisation du tampon d'homogénéisation, diluer le tampon d'homogénéisation concentré 5x (composant 1) avec de l’eau ultrapure (Annexe A). Homogénéisation • Transférer l’échantillon dans un récipient d'homogénéisation et peser sur la balance (0.45–0.70 g). • Ajouter dix fois le volume du tampon d'homogénéisation dilué 1x (m/v ; par exemple 5 mL pour 0.50 g de tissu cérébral) et homogénéiser l’échantillon en utilisant l'appareil d'homogénéisation PrioGENIZER™ (programme P0 Prionics TSE), ou FASTH/MediFASTH/FASTH2 (45±5 s, 20,000±1,000 rpm) ou l'appareil d'homogénéisation Omni Tissue Homogenizer (60±10 sec à vitesse maximale). PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation • Conserver deux échantillons de 1 mL par homogénat dans une plaque matrice de 96 puits (à partir d'ici, chaque étape se fera avec deux échantillons pour chaque homogénat original). • Les flacons d’homogénéisation PrioCLIP™ et Prypcon des échantillons testés "TSE négatifs" peuvent être lavés pour être réutilisés (voir protocole de lavage des flacons PrioCLIP™ et Prypcon, Annexe D). Digestion par une protéase Les quantités suivantes sont données pour 48 échantillons. (Voir Annexe B pour les volumes requis pour un nombre d'échantillons différent de 48.) Préparation • Ajuster la température de l’incubateur de la plaque de microtitrage à 48±1°C approximativement 1 heure avant utilisation. • Ajouter 10 µL de tampon de digestion (composant 2) dans chaque puits de la plaque de digestion. Digestion par une protéase • Transférer 100 µL (mélanger d'abord en aspirant et en évacuant au moins trois fois avec la pipette) de chaque homogénat de la plaque matrice dans le puits correspondant de la plaque de digestion, avec une pipette multicanal. La plaque matrice peut ensuite être recouverte et conservée jusqu'à 12 mois de −20°C à −80°C. • Ajouter 10 µL de protéinase K (composant 3) à chaque puits de la plaque de digestion et mélanger en aspirant/évacuant à la pipette au moins trois fois. • Placer un film de scellement sur la plaque de digestion. • Digérer pendant 40±1 min à 48±1°C. • Interrompre la réaction en ajoutant 10 µL de la solution d’arrêt de la digestion (composant 4). Mélanger par pipetage au moins trois fois. Electrophorèse en gel Préparation • Préparation des gels NuPAGE™ 12% à 17 puits : enlever délicatement le peigne et la bande adhésive blanche au bas du gel. • Chauffer l'échantillon de contrôle (composant 5) à 65±3°C pendant 2–5 min. • Régler la température de l'incubateur pour plaque de microtitrage à 98±4°C, environ 1 heure avant l'utilisation. Electrophorèse en gel • Ajouter 100 µL de tampon de charge (composant 6) à l'homogénat digéré dans la plaque de digestion et mélanger en pipetant au moins trois fois. • Faire bouillir les échantillons à 98±4°C pendant 5 min±30 s. • La plaque de digestion peut être recouverte avec un film de scellement et conservée jusqu'à 5 jours de −20°C à −80°C. • Les échantillons préparés précédemment sont chauffés à to 65±3°C pendant 2–5 min avant d'être déposés. Dépôt des échantillons • Déposer 10 µL de l'échantillon de contrôle dans le premier puits. • Déposer 10 µL des échantillons chauffés par puits. • Remplir la cuve intérieure et extérieure avec la solution tampon pour électrophorèse 1x NuPAGE™ SDS-MOPS et ajouter 500 µL d'antioxydant NuPAGE™ uniquement dans la cuve intérieure. Electrophorèse • Faire migrer sous une tension de 200 V jusqu'à ce que le front de migration se trouve à 1–2 cm du bas du gel (environ 30 min). Transfert Préparation • Laver la membrane PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0.45 µm, 13 × 17 cm) dans du méthanol (environ 98%) pendant quelques secondes. L'équilibrer pendant au moins 10 min dans le tampon de transfert 1x (pour les volumes requis, voir Annexe B). • Remplir la cuve de transfert avec le tampon de transfert 1x refroidi (5±3°C). • Transférer à 150 V pendant 60±2 min à 5±3°C sous refroidissement continu. • Retirer la membrane et colorer les protéines présentes sur la membrane au Rouge Ponceau S. Repérer la position des marqueurs moléculaires. La décoloration se fait avec du TBST jusqu’à ce que la coloration rouge ait disparu (environ 2 × 1 min). Détection immunologique Blocage • Incuber la membrane dans un bac d’incubation en plastique avec 50±2 mL de tampon de blocage PVDF 1x (composant 7 ; voir Annexe A pour le schéma de dilution) pendant 35±5 min à 22±3°C sur un agitateur basculant avec agitation douce. 1er anticorps • Diluer 10 µL du premier anticorps 6H4 (composant 8) dans 50±2 mL de TBST (dilution 1:5000), y incuber la membrane pendant 60±5 min à 22±3°C (ou pendant 12–18 heures à 5±3°C) sous agitation douce sur un agitateur basculant. • Rincer 3x les membranes pendant environ 5 min avec du TBST. 2ème anticorps • Diluer 10 µL du deuxième anticorps-AP (composant 9) dans 50±2 mL de TBST (dilution 1:5000). Incuber pendant 30±1 min à 22±3°C sous agitation douce. • Rincer 5x les membranes pendant environ 5 min avec du TBST. Détection • Equilibrer la membrane pendant 5–10 min dans 50±2 mL de solution tampon de luminescence 1x (composant 10 ; voir Annexe A pour le tableau de dilution). • Diluer 100 µL de CDP-Star (12.5 mM ; 50x) ou 50 µL (25 mM ; 100x) dans 5 mL de tampon de luminescence 1x. • Placer la membrane sur une plaque de verre. Répartir uniformément 5 mL de la solution CDP-Star diluée ou 5 mL de la solution prête à l’emploi sur la membrane et incuber pendant 5±1 min à 22±3°C. • Enlever l’excès de liquide restant sur la membrane avec un papier absorbant doux et recouvrir immédiatement la membrane avec du cellophane. Exposer la membrane à un film Hyperfilm ECL jusqu’à ce que le signal du contrôle positif soit intense et que le bruit de fond ou la bande de la protéinase K apparaisse (environ 5 à 20 min). Exposer plus longtemps ou moins longtemps pour obtenir un signal optimal. Alternativement, un système de détection par caméra CCD peut être utilisé (par ex. FluorChem™, Alpha Innotech Corp.). Interprétation des résultats La figure ci-dessous montre les résultats attendus pour des échantillons négatifs pour l’EBS, positifs pour l’EBS, positifs pour la tremblante et des échantillons témoins. L’échantillon témoin (K) contient l’isoforme normale de la protéine prion (PrPC), visualisée via la détection immunologique. La bande diffuse correspondante de 25–35 kD est due à la glycosylation de PrPC, qui provoque une distribution hétérogène. K Transfert Réalisation du sandwich de transfert • Placer la membrane sur du papier Whatman imbibé de tampon de transfert 1x ou d'eau ultrapure. • Casser le carde en plastique du gel NuPAGE™. Enlever le haut du gel contenant les puits et le bas au-dessous du front coloré. Placer le reste du gel sur la membrane (éviter les bulles d'air). On peut placer jusqu'à 6 gels sur une même membrane de la taille ci-dessus (voir Annexe C). • Recouvrir les gels avec du papier Whatman imbibé, puis avec la deuxième éponge. • Fermer la cassette de transfert et la placer dans la cuve de transfert. Les protéines ont une charge négative et migrent vers le pôle positif (rouge) de la cuve de transfert. S'assurer que la cassette est insérée avec la membrane PVDF faisant face au pôle positif et les gels faisant face au pôle négatif. PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation N N ESB fort ESB faible D 31 kDa A B C Les échantillons négatifs (N) ne donnent pas de signal spécifique. La bande à 31 kD (qui n’est pas toujours visible) résulte d’une fixation non spécifique de l’anticorps secondaire à la protéinase K et elle peut servir de marqueur additionnel pour l’orientation. Les échantillons positifs (ESBfort ; ESBfaible) donnent des signaux en trois bandes, la bande du haut (A) correspond à une protéine de poids moléculaire d’environ 30 kD. L’intensité du signal de toutes les bandes (en particulier celle des bandes du bas B et C) peut être plus faible que ce qui apparaît sur cette figure mais la bande du haut (A) devrait toujours être clairement visible. La 3 flèche (D) illustre la différence de poids moléculaire entre la protéine prion pathogène digérée et la protéine normale non digérée. Si ce test est destiné à être utilisé pour le dépistage, un échantillon répété réactif doit être confirmé par le laboratoire national de référence en utilisant une méthode de confirmation supplémentaire. Si il est utilisé pour confirmation, ce test ne peut être utilisé qu’en conjonction avec les recommandations de l'OIE/LRUE. Annexe A - Schémas pour la préparation des solutions diluées Solution d’homogénéisation 1x Mélanger les volumes indiqués d’eau ultra pure et de tampon d’homogénéisation 5x (composant 1) pour obtenir le volume désiré de solution d’homogénéisation 1x : Durée de conservation de la solution d’homogénéisation 1x : 1 semaine à 5±3°C. Vol. du tampon d’homogénéisation (1x) 250 mL 500 mL 1000 mL = = = Volume du tampon d’homogénéisation concentré (5x) (composant 1) 50 mL 100 mL 200 mL Volume d’eau ultrapure + + + 200 mL 400 mL 800 mL Tampon de blocage PVDF Vol. de tampon blocage PVDF (1x) 500 mL Vol. de tampon de blocage PVDF (5x) (composant 7) 100 mL = Vol. d’eau ultrapure + Taille du plateau (cm) Grand (22.4 × 15.6) Grand (22.4 × 15.6) Moyen (15 × 11.4) Moyen (15 × 11.4) Petit (5.5 × 9.5) 270 mL = + CDP-Star 12.5 mM 25 mM 50 mL 10 µL 5 mL 100 µL 50 µL 50 mL 10 µL 4 mL 80 µL 40 µL 25 mL 5 µL 3 mL 60 µL 30 µL 25 mL 5 µL 3 mL 60 µL 30 µL 10 mL 2 µL 2 mL 40 µL 20 µL Membrane 400 mL Vol. d’eau ultrapure Tampon de luminescence Schéma recommandé pour le placement de gels sur la membrane de transfert. • Plaque de 96 puits avec 48 échantillons en double, transférés sur six gels à 17 puits. • Les numéros indiquent les échantillons 1–48 (M = marqueur moléculaire avec PrPC non digérée). M, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7, 8, 8 M,17,17,18,18,19,19,20,20,21,21,22,22,23,23,24,24 243 mL M, 9, 9,10,10,11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16,16 Gel 2 Gel 1 Mélanger les volumes indiqués d’eau ultra pure et de tampon de luminescence (composant 10) pour obtenir le volume désiré de tampon de luminescence (1x) : Vol. de tampon de luminescence (10x) (composant 10) 27 mL 2ème anticorps Annexe C - Schéma de placement de gels sur la membrane de transfert Tampon de luminescence Vol. de tampon de luminescence (1x) TBST M,25,25,26,26,27,27,28,28,29,29,30,30,31,31,32,32 Gel 4 Gel 3 Tampon de migration pour NuPAGE SDS-MOPS 1x ™ Vol. de tampon de migration NuPAGE™ SDS-MOPS (1x) 1000 mL Vol. de tampon de migration NuPAGE™ SDS-MOPS (20x) = Vol. d’eau ultrapure 50 mL + M,33,33,34,34,35,35,36,36,37,37,38,38,39,39,40,40 950 mL Gel 5 Tampon de transfert Vol. de tampon de transfert (1x) 2000 mL = Vol. de tampon de transfert (10x) 200 mL + Vol. d’eau ultrapure 1600 mL + + Vol. d’eau ultrapure 950 mL + Vol. de méthanol (98%) 200 mL TBST Vol. de TBST (1x) 1000 mL Vol. de TBS (20x) = 50 mL 50% Tween 20 1 mL Ponceau S Vol. de Ponceau S (1x) 1000 mL = Vol. de Ponceau S (20x) 50 mL Vol. de TBST (1x) 950 mL + 6 4 3 2 1 Taille du plateau (cm) Grand (22.4 × 15.6) Grand (22.4 × 15.6) Moyen (15 × 11.4) Moyen (15 × 11.4) Petit (5.5 × 9.5) Gel 6 Annexe D - Protocole de lavage des flacons PrioCLIP™/Prypcon Instructions générales Traçabilité de l’échantillon Les flacons d’homogénéisation PrioCLIP™/Prypcon doivent porter le numéro de l’échantillon—apposé, par ex. à l’aide d’un marqueur ou d’étiquettes résistants à l’eau—afin de garantir la traçabilité de l’échantillon. Le marquage des flacons ne peut être ôté qu’après la remise des résultats. Traçabilité de l’utilisation des PrioCLIP™/Prypcon Annexe B - Volumes requis pour divers nombres d’échantillons No. de gels M,41,41,42,42,43,43,44,44,45,45,46,46,47,47,48,48 Taille de la membrane TBST 1er anticorps 13 × 17 cm 50 mL 10 µL 9 × 17 cm 50 mL 10 µL 13 × 8.5 cm 25 mL 5 µL 9 × 8.5 cm 25 mL 5 µL 4.5 × 8.5 cm 10 mL 2 µL Les flacons d’homogénéisation ne doivent pas être utilisés plus de 5 fois. Les flacons PrioCLIP™/Prypcon doivent être marqués d’un trait ou d’un point à l’aide d’un marqueur résistant à l’eau après chaque utilisation. Ne pas utiliser de désinfectants à base d’hypo-chlorite pour le lavage. Préparation • Remplir deux récipients d’une quantité suffisante d’eau désionisée (au moins 25 L), afin de permettre l’immersion complète des flacons PrioCLIP™/Prypcon durant les étapes du lavage. Egouttement • Vider les flacons contenant des homogénats "TSE négatifs" dans une bouteille autoclavable thermo-résistante ou dans une boîte/flacon jetable. • Les flacons dont le contenu a été identifié comme « initialement réactif » ne doivent pas être réutilisés et doivent être éliminés conformément aux directives nationales de sécurité. Lavage • Immerger les flacons PrioCLIP™ /Prypcon vides dans un récipient contenant de l’eau désionisée, rincer abondamment. • Inspecter visuellement les flacons d’homogénéisation en cherchant des détériorations éventuelles et une possible contamination par du tissu, lors du transfert du premier récipient au second récipient. Eliminer tout flacon d’homogénéisation PrioCLIP™/Prypcon abîmé ou contaminé. • Immerger les flacons et les incuber pendant au moins 30 min à 22±3°C. Séchage • Sortir les flacons PrioCLIP™/Prypcon du récipient, secouer pour éliminer l’eau résiduelle et les laisser sécher complètement à 22±3°C. 4 PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation • Il est également possible de faire sécher les flacons PrioCLIP™/Prypcon dans une étuve de séchage. Placer les flacons sur une surface résistante à la chaleur, les chauffer pendant 2 heures à 85±5°C et faire sécher pendant une nuit à 50°C dans une étuve de séchage. Répéter l’étape de chauffage (2 heures, 85±5°C). • Contrôler visuellement les flacons PrioCLIP™/Prypcon. Eliminer les flacons qui sont abîmés ou contiennent des résidus de liquide ou de tissu. • Les flacons PrioCLIP™/Prypcon sont maintenant prêts à être réutilisés. Elimination des déchets • Les homogénats et les solutions de lavage doivent être éliminés conformément aux directives nationales de sécurité. Un protocole de lavage détaillé pour PrioCLIP™/Prypcon (avec illustrations) peut être demandé au Support Technique. Annexe E - Certification par l’OIE : résumé des études de validation Caractéristiques analytiques Sensibilité analytique • Des séries de dilution furent testées dans le cadre de l’étude de validation de l’Union Européenne. Sur 20 homogénats positifs testés à une dilution de 10-1, 15 s’avérèrent positifs, deux douteux et trois négatifs. Deux échantillons s'avérèrent également douteux à 10-2 et un seul échantillon à une dilution de 10-2.5. [Les échantillons positifs furent fournis par le Central Veterinary Laboratory (CVL), Weybridge : des échantillons de tronc cérébral et de moëlle épinière furent sélectionnés à partir de bovins présentant des signes cliniques d’ESB confirmés par un examen histologique.] Spécificité analytique • Ceci n’a pas été spécifiquement examiné. Cependant, certaines études de terrain, utilisant des échantillons prélevés sur des animaux trouvés morts (animaux souffrant de troubles autres que l’ESB, par ex. encéphalite, œdème cérébral, rage, listériose), ont constamment montré que le PrioWESTERN BSE Kit dispose d’une bonne spécificité analytique [cf. D. Heim et al. (2000) Surveillance of BSE. Arch Virol Suppl. (16):127–33)]. Données de répétabilité • Les tests effectués sur une période allant de 2002 à 2007 indiquent que le kit pourrait détecter un échantillon positif pour l’ESB à une dilution de 1:10. • La répétabilité fut également étudiée lors d’un essai comparatif de trois tests ESB (Enfer – Bio-Rad Te SeE – PrioWESTERN BSE Kit), réalisé par le Laboratoire de Référence Européen de l’ESB (VLA, Royaume-Uni). La cohérence entre les échantillons duplicats (n = 277) était élevée, à l’exception de deux cas où le report d’un puits positif adjacent entraina une petite bavure non spécifique dans l’un des puits adjacents d’un échantillon négatif. Ceci était clairement différent des résultats positifs, qui étaient de taille caractéristique, en forme de bandes et présentes à la fois dans les deux puits dupliqués. Caractéristiques du diagnostic Détermination du seuil Ce test ne donne pas de lecture quantitative. La réponse est qualitative et est basée sur les deux critères de présence du signal et de sa position. Ceci permet une discrimination aisée entre les vrais positifs et les (potentiellement) faux positifs par suite de la PrP normale non digérée. Estimations de la sensibilité diagnostique (SeD) et de la spécificité diagnostique (SpD) Trois études d’évaluation externes ont été décrites pour l’estimation de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques : • Tests réalisés au Laboratoire de Référence Suisse de l'ESB (NeuroCentre/Université de Berne) en février 2003 sur 38 échantillons positifs (18 homogénats & 20 échantillons tissulaires) du RU/190 échantillons négatifs du programme de surveillance Suisse de l’ESB (échantillons tissulaires de bovins de plus de 30 mois qui avaient été testés négatifs par histologie/immunohistochimie). ESB positif par IHC ESB négatif par IHC Test Positif par 38 PrioWESTERN BSE Kit Test Négatif par 0 PrioWESTERN BSE Kit Sensibilité diagnostique : 100%, CI [90.7 –100.0%] Spécificité diagnostique : 100%, CI [98.1–100.0%] PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation 0 190 • Etude de terrain canadienne, 2003. Faisant suite à la détection du cas référencé en mai 2003, 2036 cohortes de naissance et d’alimentation furent testées par immunohistochimie (IHC) et par le PrioWESTERN BSE Kit. Ce travail fût réalisé par les laboratoires de l’Agence d’Inspection Alimentaire Canadienne à Lethbridge, Winnipeg, Nepean et St-Hyacinthe. ESB positif par IHC ESB négatif par IHC 1 0 0 2036 Test Positif par PrioWESTERN BSE Kit Test Négatif par PrioWESTERN BSE Kit Spécificité diagnostique : 100%, CI [99.8–100.0%] • Evaluation des tests pour le diagnostic de l’Encéphalopathie Spongiforme Transmissible chez les bovins pour la Commission Européenne, 1999. Tous les échantillons furent préparés par l’Institut européen des mesures et matériaux de référence (IRMM) à Geed, Belgique et présentés à l’analyse dans un format codé « aveugle » aux différents participants (le PrioWESTERN BSE Kit était l’un des quatre kits sélectionnés) : un total de 300 échantillons positifs (prélevés à partir de bovins montrant des signes cliniques d’ESB et confirmés par examen histologique – fournis par CVL Weybridge) et de 100 échantillons négatifs (prélevés en Nouvelle Zélande à partir de bovins adultes sains agés d’au moins 4 ans et confirmés négatifs par examen histologique). ESB positif par histologie ESB négatif par histologie 300 0 0 1000 Test Positif par PrioWESTERN BSE Kit Test Négatif par PrioWESTERN BSE Kit Sensibilité diagnostique : 100%, CI [98.8 –100%] Spécificité diagnostique : 100%, CI [99.6–100.0%] Concordance entre les tests La concordance entre le PrioWESTERN BSE Kit avec l’examen histologique et l’IHC est élevée. Reproductibilité Durant l’évaluation de terrain de l’Union Européenne en 2004, des échantillons furent testés à l’aide du PrioWESTERN BSE Kit. Ces résultats furent comparés avec les résultats atteints avec d’autres tests en cours d’évaluation. Les échantillons furent divisés en trois catégories : échantillons positifs, échantillons négatifs et échantillons de faible qualité. • Un total de 335 échantillons positifs à l’ESB fut testé dans trois laboratoires (VLA, Newcastle, RU - Analytico Food BV, Heerenveen, Pays-Bas et Laboratorio Central de Veterinaria, Algete, Espagne). • Un total de 24.534 échantillons négatifs à l’ESB fut testé dans huit laboratoires (Analytico Food BV, Heerenveen, Pays-Bas ; Institut für Veterinärmedizin, Mödling, Autriche ; Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid, Lelystad, Pays-Bas ; Laboratorio EET, Leon, Espagne ; Labor Dr. Guenteert, Luzern, Suisse ; Instituto Zooprofilatiico Sperimentale del Piemonte, Turin, Italie ; Irish Equine Centre, Kildare, Irlande ; Arthus Biotech GmbH, Hamburg, Allemagne). • En plus, 423 échantillons de faible qualité furent testés dans deux laboratoires (VLA, Newcastle, RU et NeuroCentre, Berne, Suisse). Les résultats inter-laboratoires de tous les échantillons testés furent identiques pour le PrioWESTERN BSE Kit. Les concordances avec les autres tests en cours d’évaluation furent très élevées, à l’exception d’un échantillon faiblement positif détecté par le PrioWESTERN BSE Kit et qui n’avait pas été identifié comme positif lors de l’utilisation du test CediTect. Source : Rapport : The Field Trial of Seven New Rapid Post Mortem Test for the Diagnosis of Bovine Spongiform Encephalopathy in Bovines ; IRMM ; 12 Novembre 2004. Applications PrioWESTERN BSE Kit est actuellement utilisé à la fois par les Laboratoires de Référence et de routine à travers le monde entier. Les laboratoires d’essai devraient participer à des essais d’aptitude et des programmes de formation des laborantins organisés par les Laboratoires de Référence de l’OIE. Annexe F - Règles de sécurité Les laboratoires sont tenus de se conformer aux Consignes Nationales de Sécurité. Pour orientation, une directive de sécurité concernant la manipulation des protéines prions a été publiée par l'ACDP (Advisory Committee on Dangerous Pathogens): “Transmissible spongiform encephalopathy agents: safe working and the prevention of infection”, Department of Health, London, Grande-Bretagne (on peut se le procurer à l'adresse suivante: Stationery Office, ISBN 0113221665. (https://www.gov.uk/government/publications/guidance-from-the-acdptse-risk-management-subgroup-formerly-tse-working-group) 5 Annexe G - Référence 1. Oesch B, Doherr M, Heim D, Fischer K, Egli S, Bolliger S, Biffiger K, Schaller O, Vandevelde M, Moser M (2000) Application of Prionics Western blotting procedure to screen for BSE in cattle regularly slaughtered at Swiss abattoirs. Arch Virol 16:189–195. 2. Doherr MG, Oesch B, Moser M, Vandevelde M, Heim D (1999 Dec 4) Targeted surveillance for bovine spongiform encephalopathy. Veterinary Record 145:672. 3. Schaller O, Fatzer R, Stack M, Clark J, Cooley W, Biffiger K, Egli S, Doherr M, Vandevelde M, Heim D, Oesch B, Moser M (1999 Nov) Validation of a Western immunoblotting procedure for bovine PrPSc detection and its use as a rapid surveillance method for the diagnosis of bovine spongiform encephalopathy (BSE). Acta Neuropathol (Berl) 98(5):437–43. 4. Calavas D, Ducrot C, Baron T, Morignat E, Vinard JL, Biacabe AG, Madec JY, Bencsik A, Debeer S, Eliazsewicz M (2001 Jul 14) Prevalence of BSE in western France by screening cattle at risk: preliminary results of a pilot study. Vet Rec 149:55–56. 5. Heim D, Wilesmith JW (2000) Surveillance of BSE. Arch Virol (16):127–33. 6. (2012) Bovine Spongiform Encephalopathy. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Chapter 2.4.6. 7. European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy (2009) Scientific Opinion on Analytical sensitivity of approved TSE rapid test, EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA Journal 7(12):1436. Validé et certifié par l'OIE comme étant propres aux fins définies dans la présente notice. Numéro d'enregistrement : 20080102 thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 3 avril 2019 Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. Nº MAN0013787 (français) Rév. Date Description Nouveau document. Conversion effectuée du document existant (WESTERN_PI_v12.0_f_220213.doc) sur le modèle du document en A.0 3 avril 2019 cours, avec mises à jour associées aux informations de licence limitée, à la garantie, aux marques et aux logos. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2019 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. ">
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