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MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual Extraction d‘ARN n NucleoMag® RNA Mars 2024 / Rev. 07 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: info@mn-net.com Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: support@mn-net.com USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: sales-us@mn-net.com France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: sales-fr@mn-net.com MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: sales-ch@mn-net.com www.mn-net.com Extraction d‘ARN Sommaire 1 2 3 4 5 6 Composition du kit 4 1.1 Composants 4 1.2 Equipement et consommables nécessaires 5 1.3 A propos de ce manuel 5 Description du kit 6 2.1 Principe général 6 2.2 Caractéristiques du kit 6 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons biologiques 7 2.4 Système de séparation magnétique 7 2.5 Réglage de l’agitateur 8 2.6 Manipulation des billes 8 2.7 Procédures d’élution 9 Conditions de stockage et préparation des réactifs 10 Instructions de sécurité 11 4.1 Elimination 11 Protocole pour l’extraction d’ARN 12 Annexes 18 6.1 Guide de résolution des problèmes 18 6.2 Informations de commande 20 6.3 Restrictions d’utilisation / garantie 21 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 3 Extraction d‘ARN 1 Composition du kit 1.1 Composants NucleoMag® RNA REF 1 × 96 preps 744350.1 4 × 96 preps 744350.4 NucleoMag® B-Beads 2 × 1.5 mL 12 mL Tampon de lyse MR1 60 mL 250 mL Tampon de fixation MR2 80 mL 400 mL Tampon de lavage MR3 80 mL 320 mL Tampon de lavage MR4 250 mL 1000 mL Tampon d’élution MR5* 30 mL 125 mL Agent réducteur TCEP 1 flacon (107 mg / flacon) 4 flacons (107 mg / flacon) rDNase, lyophilisée** 3 flacons (dimension D) 12 flacons (dimension D) Tampon de réaction de la rDNase 30 mL 2 × 60 mL H2O RNase-free 13 mL 30 mL 1 1 Brochure d’utilisation * Tampon d’élution MR5: H2O RNase-free ** Pour la préparation des solutions et les conditions de stockage, voir chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 Extraction d‘ARN 1.2 Equipement et consommables nécessaires Produit REF Conditionnement • Système de séparation magnétique Ex: NucleoMag® SEP (voir chapitre 2.3) 744900 1 • Plaques de séparation des billes magnétiques, Ex : Square-well Block (blocs 96 puits carrés de 2,1 mL) 740481 740481.24 4 24 • Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et la lyse, ex: Rack de barrettes ’Tube Strips’ (1 set comprend 1 support, 12 barrettes de 8 tubes (1,2 mL) et 12 barrettes de bouchons. 740477 740477.24 4 sets 24 sets • Plaques d’élution pour collecter les acides nucléiques purifiés, ex: Plaque d’élution ’fond en U’ (96 puits de 0,3 mL) ex: Plaque d’élution à fond plat (96 puits de 0,3 mL) 740486.24 24 740673 20 • 1.3 Pour utilisation du kit sur KingFisher® Flex, 744951 Set d’accessoires ’KingFisher® Accessory Kit B’ (Blocs 96 puits, Tip combs, Plaques d’élution pour 4 × 96 preps NucleoMag® RNA sur KingFisher® Flex) 1 set A propos de ce manuel Nous recommandons vivement la lecture du protocole détaillé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoMag® RNA. Les utilisateurs expérimentés, quant à eux, pourront utiliser le résumé du protocole. Ce dernier est conçu pour un suivi rapide des différentes étapes de la procédure. Toute la documentation technique est disponible sur notre site internet www.mn‑net.com. MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 5 Extraction d‘ARN 2 Description du kit 2.1 Principe général La procédure NucleoMag® RNA est basée sur l’adsorption réversibles des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques en présence des tampons adéquats. La lyse de l'échantillon est menée lors de son homogénéisation dans une solution contenant des ions chaotropiques. Pour créer les conditions de fixation des acides nucléiques aux billes paramagnétiques, le tampon MR2 et les billes NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat. Après séparation magnétique, les billes sont incubées dans une solution de DNase recombinante pour l’élimination de l’ADN également fixé. Après une nouvelle étape de fixation de l’ARN aux billes, les contaminants et les sels sont éliminés avec les tampons de lavage MR3 et MR4. L’éthanol résiduel issu de ces étapes est éliminé lors d’une étape de séchage. Pour finir, l’ARN hautement purifié est élué dans le tampon d’élution MR5 et peut être directement utilisés pour les applications avales. Le kit NucleoMag® RNA est utilisable manuellement ou sur divers automates de pipetage ou divers séparateurs magnétiques automatisé. Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou des scripts validés pour de nombreuses plates-formes. Pour plus d'informations, veuillez contacter notre service d'assistance technique ou consulter notre site www.mn-net.com/automation. 2.2 Caractéristiques du kit Le kit NucleoMag® RNA est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée d’ARN hautement pur à partir de 20 mg de tissu ou de 2 × 106 de cellules. Le kit est conçu pour une utilisation avec le séparateur magnétique pour plaques 96 puits NucleoMag® SEP (voir ’Informations de commande, chapitre 6.2) ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir chapitre 2.3). La durée de la procédure manuelle pour 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ARN purifié peut être utilisé directement pour les applications comme les RTPCR ou tout autre type de réaction enzymatique. Uniquement pour la recherche. Grâce à la DNase recombinante incluse dans le kit, l’ARN est considéré comme quasiment exempt d’ADN. Le kit NucleoMag® RNA est aisément automatisable sur les plateformes courantes de manipulation de liquides ou sur les séparateurs magnétiques, comme par exemple les KingFisher® de Thermo Fisher Scientific. La durée de la procédure dépend de la configuration de l’instrument utilisé. En général, 96 échantillons peuvent être extraits en moins de 120 minutes lors de l’utilisation du NucleoMag® SEP sur un robot pipeteur. Le kit comprend tous les réactifs pour extraire jusqu’à 30 μg d’ARN purifié. En fonction du volume d’élution, des concentrations de 10 – 30 ng/μL sont obtenues. Le kit NucleoMag® RNA est entièrement utilisable à température ambiante. Les NucleoMag® B-Beads sont des billes superparamagnétiques hautement réactives. La capacité de fixation est d’environ 0,4 μg d’ARN pour 1 μL de suspension de billes NucleoMag® B-Bead. 1 μL de suspension contient 130 μg de billes. Pour plus d’informations, visitez notre site web : www.mn-net.com/bioanalytik/htp-information 6 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 Extraction d‘ARN Chez MN, nous vous proposons des scripts pour différentes plateformes. Il vous suffit de nous contacter et nous vous ferons suivre le script. Si vous êtes à la recherche de solutions plus personnalisées, nous pourrons également vous aider. Contactez-nous et nous ferons de l’automatisation pour vous une expérience agréable grâce à notre soutien. 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons biologiques Environnement de travail Maintenir un environnement de travail exempt de RNase. Portez des gants à tout moment pendant la préparation. Changez fréquemment de gants. Stockage des échantillons et inhibition des RNase • Les RNases peuvent rapidement dégrader l’ARN des échantillons si ceux-ci ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la récolte. Les méthodes suivantes sont recommandées pour éviter la dégradation de l’ARN : • Utiliser un échantillon fraîchement récolté pour une lyse et une purification immédiate de l’ARN. • Submerger et conserver les échantillons dans des solutions de stabilisation NucleoProtect® RNA ou similaires. Veillez à ce que l’échantillon soit complètement imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirez l’excès de solution de stabilisation de l’échantillon avant d’extraire l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la solution de stabilisation. • Congeler l’échantillon dans de l'azote liquide immédiatement après la récolte et conservez-le à -70 °C. Les échantillons ainsi congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. S’assurer que l’échantillon ne décongèle pas avant d’être repris dans le tampon de lyse. • Conserver les échantillons dans le tampon de lyse MR1 après broyage à -70 °C jusqu’à un an, à 4 °C pour maximum 24 heures ou à température ambiante pendant quelques heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse MR1 doivent être décongelés lentement avant de commencer l’extraction des ARN. 2.4 Système de séparation magnétique Pour utiliser le NucleoMag® RNA, nous recommandons le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. La séparation s’effectue dans un bloc 96 puits carrés (voir ’Informations de commande’ chapitre 6.2). Le kit peut aussi être utilisé avec d’autres séparateurs magnétiques. Consulter les informations du fabricant pour connaître les plaques de séparation appropriées. Séparateur magnétique Plaque ou tube de séparation NucleoMag® SEP (MN REF 744900) Bloc 96 puits carrés (MN REF 740481/.24) Tecan Te-MagS™ Tubes 1.5 mL sans bouchons (Sarstedt) Séparation à aimants statiques Les séparateurs à aimants statiques, par exemple notre NucleoMag® SEP (utilisation manuelle ou sur robot pipeteur), sont recommandés en association avec un agitateur à plaques pour MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 7 Extraction d‘ARN une resuspension optimale des billes lors des étapes de lavage et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles d’aspiration / refoulement. Pour une automatisation totale de la procédure sur un automate de pipetage, un bras ’gripper’ est nécessaire pour le transfert des plaques de séparation de l’aimant vers l’agitateur et inversement. Systèmes à aimants mobiles Les séparateurs à aimants mobiles font bouger les aimants d’un côté à l’autre des puits, entrainant ainsi les billes à travers les solutions de lavage et d’élution. La séparation magnétique a lieu lors de l’arrêt des aimants. Séparateurs automatisés Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou plaque correspondant à la solution suivante. 2.5 Réglage de l’agitateur Lors de l’utilisation d’un agitateur à plaques pour les étapes de lavages et d’élution, les paramètres d’agitation doivent être ajustés précautionneusement afin de garantir la bonne resuspension des billes tout en évitant tout risque de contaminations croisées. Réglage de l’agitation pour les étapes de lavages : • Déposer 900 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et lancer l’agitation à vitesse modérée pendant 30 secondes. Stopper et vérifier l’absence de projections. • Augmenter la vitesse d’agitation sur une durée de 30 secondes supplémentaire et vérifier l’absence de projections. • Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à observer des projections sur le dessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite progressivement la vitesse, vérifier l’absence de projections et utiliser ce réglage pour les étapes de lavages. Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution : • Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation et procéder comme mentionné ci-dessus. 2.6 Manipulation des billes Distribution des billes Une distribution homogène des billes dans les puits de la plaque de séparation est essentielle pour une bonne reproductibilité. Avant de distribuer les billes, veiller à bien les resuspendre. Agiter le flacon ou placer le sur un vortex brièvement. Le mélange préliminaire des billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, une étape de mélange des billes et du tampon de fixation dans les réservoirs avant leur distribution dans les plaques de séparation est recommandée afin de s’assurer que les billes demeurent bien en suspension. 8 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 Extraction d‘ARN Durée de séparation magnétique L’attraction des billes magnétiques par les aimants dépend de la force de l’aimant, du type de plaque de séparation utilisé, de la distance entre les parois des puits et les aimants ainsi que du volume présent dans les puits. Les temps d’aimantation des billes doivent être ajustés en fonction de chaque système. Il est recommandé d’utiliser des plaques ou tubes de séparation validés pour le type de séparateur magnétique utilisé. Lavages des billes Le lavage des billes est effectué par agitation ou pipetage. Contrairement au pipetage, l’agitation permet la resuspension des billes dans tous les puits simultanément. Ceci permet de réduire le temps de la procédure et le nombre de cônes nécessaires. Cependant, la resuspension par pipetage est plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique. Méthode Efficacité de resuspension Rapidité Nombre de cônes Magnétique + ++ Faible Agitateur ++ ++ Faible Pipetage +++ +* Elevé +: acceptable, ++: bon, +++: excellent, * Pipette 8-caneaux 2.7 Procédures d’élution L’ARN purifié peut être élué directement dans le tampon d’élution MR5 fourni. L’élution s’effectue dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel que les billes NucleoMag® B-Beads soient totalement recouvertes par le tampon d’élution. Le volume minimal nécessaire dépend du système de séparation magnétique (ex : la position des culots de billes dans les puits de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, les culots de billes magnétiques doivent être totalement resuspendues dans le tampon MR5. Avec certains séparateurs magnétiques, le volume d’élution nécessaire pour recouvrir les billes peut être plus important. MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 9 Extraction d‘ARN 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention: les tampons MR1 et MR3 Porter des gants et des lunettes de protection ! contiennent des sels chaotropiques ! ATTENTION: les tampons MR1 et MR3 contiennent du thiocyanate de guanidine, pouvant former des composants hautement réactifs en présence d’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou des solutions acides dans les déchets liquides issus de la procédure. • Tous les composants du kit NucleoMag® RNA doivent être conservés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables : voir l’étiquette sur le kit. • Tous les tampons sont fournis prêt à l’emploi. Avant de démarrer la procédure NucleoMag® RNA, préparer: • Solution de rDNase : Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free dans chaque flacon de rDNase et incuber pendant 1 min à température ambiante. Retourner doucement le flacon pour dissoudre complètement l’enzyme. Veiller à ne pas mélanger vigoureusement car la rDNase est sensible à l’agitation mécanique. Cette solution peut être conservée à -20 °C pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler / décongeler plus de trois fois la solution. • Mélange réactionnel de rDNase : Ajouter 9.2 mL de tampon de réaction pour rDNase à 800 μL de solution de rDNase et mélanger. Le mélange réactionnel obtenu est suffisant pour 32 extractions et est à utiliser rapidement. Lors de séries inférieures à 32 échantillons, préparer un volume plus petit de mélange réactionnel. Pour chaque extraction, mélanger 276 µL de tampon de réaction et 24 µL de solution de rDNase. • Agent réducteur TCEP : Ajouter 750 μL d’H2O RNase-free dans le flacon de TCEP et incuber pendant plusieurs minutes à température ambiante. Agiter le flacon pour dissoudre le TCEP dans l’eau et incuber pendant plusieurs minutes à température ambiante. Stocker la solution de TCEP à -20 °C. NucleoMag® RNA REF rDNase (lyophilisée) TCEP 10 1 × 96 preps 744350.1 4 × 96 preps 744350.4 3 flacons (dimension D) 12 flacons (dimension D) Ajouter 800 μL H2O RNasefree dans chaque flacon Ajouter 800 μL H2O RNasefree dans chaque flacon 1 flacon (107 mg) 4 flacons (107 mg/flacon) Ajouter 750 µL d’H2O RNasefree Ajouter 750 μL d’H2O RNasefree dans chaque flacon MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 Extraction d‘ARN 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® RNA, portez des vêtements de protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le thiocyanate de guanidine dans les tampons MR1 et MR3 peuvent former des composés hautement réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure. Les déchets générés par le kit NucleoMag® RNA n’ont pas été testés pour la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations de sécurité locales. 4.1 Elimination Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 11 Extraction d‘ARN 5 Protocole pour l’extraction d’ARN Résumé du protocole • A propos du matériel et de l’équipement nécessaires, voir les chapitres 1.2 et 2.3. • Pour des informations sur chaque étape, voir page 18. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a bien été préparé selon les recommandations du chapitre 3. Homogénéisation / lyse des échantillons Jusqu’à 20 mg de tissus ou 2 × 10⁶ cellules 350 μL MR1 6 μL TCEP Mélanger ou broyer mécaniquement 2 3 Clarification des lysats par centrifugation, et transférer 350 μL de lysat clarifié dans un bloc 96 puits carrés Fixation de l’ARN aux billes NucleoMag® B-Beads 5,600 x g, 5 min 350 μL de lysat clarifié 28 μL NucleoMag® B-Beads 350 μL MR2 Mélanger par agitation 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Prélever le surnageant après 2 min de séparation Sécher 5 min à TA 4 Digestion de l’ADN Enlever le bloc 96 puits NucleoMag® SEP du 300 μL de mélange réactionnel rDNase Mélanger Incuber 15 min à TA 12 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 Extraction d‘ARN 5 Refixation de l’ADN 350 μL MR2 Mélanger par agitation à TA (Option: Mélanger par pipetage) Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 6 Lavage MR3 Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 600 μL MR3 Resuspension : agiter 5 min à TA (Option : Mélanger par pipetage) Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 7 Lavage MR4 (1er) Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 900 μL MR4 Resuspension : agiter 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 8 Lavage MR4 (2ième) Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 900 μL MR4 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 13 NucleoMag® RNA Resuspension : agiter 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Eliminer le surnageant après 2 min de séparation 9 Séchage Laisser le bloc sur le NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA 10 Elution de l’ARN Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 50‑200 μL MR5 Agiter 5 – 10 min à TA (Option : Mélanger par pipetage) Séparer les billes pendant 2 min et transférer l’ARN dans une plaque / des tubes d’élution 14 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07 NucleoMag® RNA Protocole détaillée Ce protocole décrit la procédure utilisant un séparateur magnétique à aimants fixes (ex: NucleoMag® SEP) associé à un agitateur de plaque adéquat (voir paragraphe 2.3). Il est recommandé d’utiliser les bloc 96 puits carrés ’Square-well Block” pour les étapes de séparation magnétique (voir paragraphe 1.2). Autrement, l’extraction de l’ARN est réalisable en tubes avec un séparateur approprié. Ce protocole détaille la procédure manuelle et peut servir de guide pour l’automatisation du kit. Avant de débuter la préparation: • 1 Vérifier que la rDNase a bien été préparée selon les recommandations du chapitre 3. Homogénéisation / lyse des échantillons Lyser jusqu’à 20 mg de tissus ou 2 × 10⁶ cellules dans 350 μL de tampon MR1 + 6 μL TCEP. Pour les échantillons de tissus : utiliser un système de broyage approprié pour homogénéiser les échantillons dans le tampon MR1. Les échantillons peuvent être par exemple broyés au moyen d’un système à billes, par ex: GenoGrinder* ou Mixer Mill MM400** (voir les recommandations du fabricant à propos des tubes et plaques compatibles), ou tout autre système de broyage similaire. Pour les cellules : Ajouter le tampon MR1 sur le culot de cellules. Mélanger par plusieurs cycles de pipetage pour lyser les cellules. Option : utiliser les colonnes NucleoSpin® Filters ou les plaques NucleoSpin® RNA Filter Plates (voir paragraphe 6.2) ou encore une seringue pour réduire la viscosité du lysat. Transférer le lysat dans un bloc 96 puits carrés pour la suite de la procédure. 2 Clarification des lysats Centrifuger les échantillons pendant 5 min à vitesse élevée (5,600 – 6,000 x g). Enlever les barrettes de bouchons. Transférer 350 μL de lysat clarifié dans un bloc 96 puits carrés. Veiller à ne pas contaminer les bords des puits pour éviter tout risque de contaminations croisées. Note: consulter nos recommandations à propos des différentes plaques ou tubes utilisables et leur compatibilité avec les séparateurs magnétiques (voir paragraphe 1.2). En option : les colonnes NucleoSpin® Filter ou les plaques NucleoSpin® RNA Filter Plates peuvent être utilisés pour clarifier les lysats (voir paragraphe 6.2). Transférer les surnageants limpides dans les puits du bloc 96 puits carrés (voir paragraphe 6.2) pour la suite de la procédure. * GenoGrinder: http://www.spexcsp.com/sampleprep/ ** Mixer Mill MM400 http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/mm-400/ MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07 15 NucleoMag® RNA 3 Fixation de l’ARN aux billes NucleoMag® B-Beads Ajouter 28 μL de suspension de billes NucleoMag® B-Beads et 350 μL de tampon MR2 aux lysats. Mélanger en agitant pendant 5 min à température ambiante ou en pipetant le mélange au moins 6 fois, puis en incubant à TA pendant 5 minutes. Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon MR2 peuvent être mélangés au préalable. Veiller à bien resuspendre les billes NucleoMag® B-Beads avant de les prélever dans le flacon. Vortexer brièvement le flacon afin d’obtenir une suspension de billes homogène. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min afin que toutes les billes aient été attirées vers les aimants. Retirer et jeter le surnageant par pipetage en veillant d’éliminer la totalité du surnageant. Note: ne pas perturber les culots de billes pendant l’aspiration des surnageants. Les culots de billes magnétiques ne sont pas visibles à cette étape. Pipeter le surnageants du côté opposé des puits. Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Conserver le bloc sur le séparateur NucleoMag® SEP pendant l’étape de séchage. 4 Digestion de l’ADN Enlever le bloc du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de mélange réactionnel de rDNase et resuspendre les billes par pipetage. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Garder les billes en suspension ! 5 Refixation de l’ARN Ajouter 350 μL de tampon MR2 à chaque échantillon. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou en pipetant au moins 6 fois puis incuber 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques contre les parois des puits en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants. 6 Lavage MR3 Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 600 μL de tampon MR3 dans chacun des puits et resuspendre totalement les billes par agitation (5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants. 16 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07 NucleoMag® RNA 7 1ier lavage MR4 Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon MR4 dans chacun des puits et resuspendre totalement les billes par agitation (5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants.emove the Square-well Block from the NucleoMag® SEP magnetic separator. 8 2ième lavage MR4 Répéter le lavage précédent avec 900 μL de tampon MR4. Laisser le bloc sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour la prochaine étape. 9 Séchage Sécher les billes à l’air libre pendant 10 – 15 min à température ambiante. 10 Elution de l’ARN Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume adéquat de tampon MR5 (au moins 50 μL, 50 – 200 μL) et resuspendre les billes par agitation jusqu’à resuspension totale de toutes les billes (5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Transférer les surnageants contenant l’ARN purifié dans un tube ou une plaque de collecte appropriée (voir paragraphe 6.2). MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07 17 NucleoMag® RNA 6 Annexes 6.1 Guide de résolution des problèmes Problèmes Causes possible et suggestions Contamination par des RNases • ARN dégradé / Aucun ARN obtenu Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants fréquemment. L'utilisation de consommables stériles, de tubes ou de plaques en polypropylène est recommandé. Les contenants en verre doivent avoir été autoclavés pendant au moins 2 h à 250 °C avant utilisation. Volume de tampon d’élution insuffisant • Les culots de billes doivent être totalement recouverts par le tampon d’élution. Performance insuffisante du tampon d’élution • Eliminer complètement les tampons résiduels à chaque étape de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des étapes de lavages et d’élution. Billes séchées excessivement Rendement faible • Ne pas laisser les billes sécher excessivement, l’efficacité de l’élution en serait impactée. Aspiration du culot de billes présents sur l’aimant • Ne pas perturber les culots de billes sur l’aimant lors de l’aspiration des surnageants, en particulier lors de la première séparation lorsque les culots ne sont pas visibles dans les lysats. Aspiration et perte de billes • Le temps de séparation magnétique est trop court ou la vitesse d’aspiration trop élevée lors du pipetage des liquides. Procédure de lavage insuffisante • Utiliser uniquement des plaques ou tubes recommandés pour les séparateurs magnétiques, par exemple les blocs 96 puits carrés ’Square-well Block’ en association avec le séparateur NucleoMag® SEP. • Veiller à resuspendre totalement les billes pendant les lavages. Si l’agitation est insuffisante, mélanger par pipetage. Pureté faible 18 MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07 NucleoMag® RNA Problèmes Causes possible et suggestions Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage Performance insuffisante de l’ARN dans les applications avales • Eliminer complètement les solutions de lavage après les séparations, l’éthanol impacte négativement les applications. Pureté insuffisante • Voir ci-dessus. Durée de séparation magnétique insuffisante • Perte de billes Augmenter le temps de séparation pour permettre aux billes d’être attirées totalement par les aimants avant d’aspirer le liquide contenu dans les puits. Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution) • Une vitesse d’aspiration trop élevée pendant l’élution peut induire une perte de billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution. Contamination des parois Contaminations croisées • Ne pas contaminer le haut des parois des puits du bloc lors du transfert des lysats. Si le haut des puits est contaminé, sceller le bloc avec un film adhésif en PE (voir paragraphe 6.2) avant de débuter l’agitation. MACHEREY-NAGEL – 05/2023, Rev. 07 19 Extraction d‘ARN 6.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement 744350.1 1 × 96 preps 744350.4 4 × 96 preps NucleoSpin Filters 740606 50 NucleoSpin® RNA Filter Plates 740711 4 NucleoMag® SEP 744900 1 Square-well Blocks 740481.4 4 24 ® NucleoMag RNA ® 740481.24 Films adhésifs en PE 740676 50 feuilles Rack de barrettes de tubes ’Tube Strips’ (set contenant: 1 rack, 12 barrettes de 8 tubes, et 12 barrettes bouchons) 740477.4 740477.24 4 sets 24 sets Barrettes de bouchons 740638 30 barrettes Pour utilisation de l’instrument KingFisher® Flex : Ex: set d’accessoires ’KingFisher® Accessory Kit B’ 744951 Blocs 96 puits, tip combs, plaques d’élution pour 4 × 96 preps NucleoMag® RNA 1 set Visiter notre site web www.mn-net.com pour des informations plus détaillées. 20 MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 Extraction d‘ARN 6.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter: MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel.: +49 24 21 969 333 support@mn-net.com Marques déposées: KingFisher est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd., Suisse Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. MACHEREY-NAGEL – 03/2024, Rev. 07 21 A0xxxx/xxxx.xx www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 info@mn-net.com CH +41 62 388 55 00 sales-ch@mn-net.com FR +33 388 68 22 68 sales-fr@mn-net.com US +1 888 321 62 24 sales-us@mn-net.com