Macherey-Nagel NucleoSpin Dx RNA Blood, IVD kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Bioanalysis
Mode
d’emploi
User manual
ARN de sang stabilisé
n NucleoSpin® Dx RNA Blood
Dispositif médical de diagnostic in vitro
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. · 11 52355 Düren · Allemagne
Tél. : +49 24 21 969-0
Septembre 2023 / ​Rév. 01
www.mn-net.com
www.mn-net.com
740201.50
50 prép.
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Germany and international
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
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+49 24 21 969-0
Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only)
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Technical Support Bioanalysis
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ARN de sang stabilisé
Table des matières
1 Détail des composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et matériel à fournir par l’utilisateur
5
1.3 À propos de ce mode d’emploi
5
2 Description du produit
6
2.1 Usage prévu
6
2.2 Limites d’utilisation du produit
6
2.3 Contrôle qualité
6
2.4 Présentation du kit et de ses spécifications
6
2.5 Performances analytiques et cliniques
8
2.6 Manipulation, préparation et conservation des équipements indispensables
10
2.7 Procédures d’élution
11
3 Conditions de conservation et préparation des solutions de travail
12
4 Consignes de sécurité
14
4.1 Élimination
14
5 Extraction d’ARN à partir d’un tube S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT à l’aide du
15
kit NucleoSpin® Dx RNA Blood
5.1 Mode opératoire résumé
16
5.2 Procédure détaillée
17
6 Annexe
19
6.1 Guide de résolution des problèmes
19
6.2 Exigence de notification
21
6.3 Bibliographie générale
21
6.4 Références
22
6.5 Explication des pictogrammes
22
6.6 Limites d’utilisation du produit et garantie
22
Septembre 2023 / Rév. 01
3
ARN de sang stabilisé
1
Détail des composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® Dx RNA Blood
REF
Symbole
50 préparations
740201.50
Wash Buffer RB2
BUF RB2
13 mL
Wash Buffer RB3 (Concentrate)**
BUF RB3 Conc.
12 mL
Membrane Desalting Buffer MDB
BUF MDB
25 mL
BUF Reaction Buffer
7 mL
rDNase
2 flacons (taille D)
Liquid Proteinase K
Liquid Proteinase K
600 µL
RNase-free H2O
H2O
13 mL
RNA Blood Column
50
Lysis Tubes (2 mL, with lid)
Lysis Tubes
50
Elutions Tubes (1.5 mL)
Elution Tubes
50
Collection Tubes (2 mL)
Collection Tubes
150
Reaction Buffer for rDNase
rDNase, RNase-free (lyophilized)*
NucleoSpin® RNA Blood Columns (light blue
rings -plus Collection Tubes)
1
Mode d’emploi
* Pour la préparation des solutions de travail et les conditions de conservation, consulter la section 3.
4
Septembre 2023 / Rév. 01
ARN de sang stabilisé
1.2
Réactifs, consommables et matériel à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage RB3)
Consommables
•
Embouts stériles sans RNase
Matériel
•
Pipeteurs manuels
•
Mélangeur vortex
•
Dispositif de centrifugation pour tubes de microcentrifugation de 2 mL
•
Équipements de protection individuelle (par ex. : blouse de laboratoire, gants, lunettes de
sécurité)
1.3
À propos de ce mode d’emploi
Il est fortement conseillé de lire les sections détaillées des modes opératoires figurant dans le
présent mode d’emploi. La version résumée du mode opératoire est uniquement destinée à
servir d’aide-mémoire pendant la procédure de purification.
Les modes d’emploi MACHEREY‑NAGEL sont disponibles sur notre site Internet, www.
mn‑net.com.
Contacter le service d’assistance technique pour en savoir plus sur les modifications du présent
mode d’emploi par rapport aux versions antérieures.
Coordonnées de contact
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11
52355 Düren, Allemagne
Tél. : +49 24 21 969‑0
Numéro vert : 0800 26 16 000 (depuis l’Allemagne uniquement)
E-mail : info@mn-net.com
Assistance technique Bioanalyse
Tél. : +49 24 21 969‑333
E-mail : support@mn-net.com
Benutzerhandbücher in weiteren Sprachen sind im Download-Bereich auf der Produktseite
verfügbar.
Les manuels d’utilisation dans d’autres langues sont disponibles dans la section Téléchargements
de la page du produit.
Los manuales de usuario en otros idiomas están disponibles en la sección de descargas de la
pagina del producto.
Septembre 2023 / Rév. 01
5
ARN de sang stabilisé
2
Description du produit
2.1
Usage prévu
NucleoSpin® Dx RNA Blood est un kit destiné à l’extraction de l’ARN humain à partir de sang
total recueilli dans le tube S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT afin de procéder ensuite à
l’analyse diagnostique in vitro. Le produit permet d’obtenir de l’ARN humain purifié qui peut être
utilisé pour des analyses aval telles que RT-PCR, qRT-PCR ou séquençage afin de recueillir des
informations sur le taux d’expression de l’ARN dans l’échantillon. Le produit est réservé aux
utilisateurs professionnels dans les laboratoires de diagnostic.
Le kit NucleoSpin® Dx RNA Blood n’est pas destiné à être utilisé comme autotest ni pour
les tests au chevet du patient. L’utilisateur doit avoir une certaine expérience des techniques
de biologie moléculaire, notamment la manipulation d’échantillons de sang total, et d’autres
échantillons d’origine humaine potentiellement infectieux.
Il est recommandé d’utiliser les contrôles appropriés.
Seul le sang recueilli dans le tube S-Monovette® RNA Exact peut être utilisé.
Le kit est destiné à une utilisation manuelle.
2.2
Limites d’utilisation du produit
Le kit NucleoSpin® DX RNA Blood peut être utilisé pour purifier l’ARN du sang prélevé dans
le tube S-Monovette® RNA Exact. L’utilisation du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood n’a pas été
validée avec d’autres types d’échantillons (p. ex. : sang traité à l’EDTA).
Un effet inhibiteur potentiel des substances présentes dans le sang (p. ex., produits
pharmaceutiques) ne peut être complètement exclu. Il est par conséquent recommandé
d’utiliser des contrôles appropriés.
2.3
Contrôle qualité
Conformément au système d’assurance qualité en vigueur chez MACHEREY‑NAGEL, chaque
lot de kit NucleoSpin® Dx RNA Blood est testé par rapport à des spécifications prédéfinies, afin
d’assurer une qualité de produit constante.
2.4
Présentation du kit et de ses spécifications
Le kit NucleoSpin® Dx RNA Blood permet d’isoler l’ARN du sang total recueilli dans les tubes
de prélèvement sanguin S-Monovette® RNA Exact de Sarstedt. L’un des aspects les plus
importants de la purification de l’ARN est de prévenir les variations du niveau d’expression des
transcrits après le prélèvement sanguin et avant la lyse sanguine, et d’empêcher la dégradation
de l’ARN pendant le transport, la conservation et l’extraction. Grâce à la méthode NucleoSpin®
Dx RNA Blood, l’ARN est isolé à partir de sang recueilli dans le tube S-Monovette® RNA Exact
dans lequel les leucocytes (la principale source d’ARN dans le sang total) et d’autres cellules
sanguines sont lysés immédiatement lorsque le sang entre en contact avec la solution de
stabilisation présente dans le tube. Cette solution de stabilisation intégrée au tube S-Monovette®
RNA Exact inactive immédiatement les RNases (qui sont présentes dans pratiquement tous
les matériaux biologiques), facilite le transport et la conservation des échantillons sanguins
et crée des conditions de liaison appropriées qui favorisent l’adsorption de l’ARN sur la
membrane de silice. L’ADN contaminant, qui se lie également à la membrane de silice, est
éliminé par une solution de DNase recombinante (fournie) qui est directement appliquée sur la
membrane de silice lors de la préparation. Des étapes de lavage simples à l’aide d’un tampon
6
Septembre 2023 / Rév. 01
ARN de sang stabilisé
de lavage chaotropique (RB2) et d’un tampon de lavage éthanolique (RB3) éliminent les sels,
les métabolites et les composants cellulaires macromoléculaires. L’ARN pur est in fine élué dans
des conditions de faible force ionique avec de l’H₂O sans Rnase (fournie).
La préparation de l’ARN à l’aide des kits NucleoSpin® Dx RNA Blood est effectuée à température
ambiante. Il n’est pas nécessaire de disposer d’une centrifugeuse réfrigérée. Cependant, l’éluat
doit être manipulé avec précaution car l’ARN est très sensible à la contamination des RNases,
y compris sous forme de traces souvent présentes sur le matériel de laboratoire, sur les doigts
et dans la poussière. Afin de garantir la stabilité de l’ARN, l’ARN doit être congelé à -20 °C pour
une conservation à court terme ou à -70 °C pour une conservation à long terme.
•
Le kit NucleoSpin® Dx RNA Blood est recommandé pour l’extraction de l’ARN du
sang total recueilli dans les tubes de prélèvement sanguin S-Monovette® RNA Exact
de Sarstedt. Il ne doit pas être utilisé pour isoler l’ARN du sang prélevé dans d’autres
tubes de prélèvement sanguin tels que les tubes contenant de l’EDTA, du citrate ou de
l’héparine.
•
Les kits NucleoSpin® Dx RNA Blood permettent la purification de l’ARN selon un rapport
A260/A280 généralement compris entre 1,9 et 2,1 (mesuré dans un tampon TE, pH 7,5).
•
L’ARN isolé est prêt à être utilisé pour des analyses aval ultérieures telles que RT-PCR,
qRT-PCR ou séquençage afin de recueillir des informations sur le taux d’expression de
l’ARN dans l’échantillon.
•
L’ARN isolé à l’aide des kits sanguins NucleoSpin® Dx RNA Blood est généralement
d’une intégrité élevée. Cependant, l’intégrité de l’ARN dépend fortement de la qualité de
l’échantillon qui, elle-même, dépend de la température et la durée de conservation.
Le niveau de contamination par l’ADN est considérablement réduit lors de la digestion sur
colonne par rDNase. Cependant, dans des applications très sensibles, il peut être possible
de détecter des traces d’ADN. La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec :
1. le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique < cible plastidiale / ​
mitochondriale < plasmide transfecté dans les cellules.
2. la diminution de la taille de l’amplicon obtenu par PCR.
Tableau 1: Résumé des spécifications du kit
Paramètre
NucleoSpin® Dx RNA Blood
Matériau échantillonné
Solution de 1,2 mL de sang stabilisé provenant de tubes de
prélèvement sanguin S-Monovette® RNA Exact (SARSTEDT
REF 01.2048.001).
Format
Minicolonne de centrifugation
Taille du fragment
> 200 nt
Rendement généralement
constaté
> 1 μg (0,7 – 4,2 μg) par préparation à partir de sang de
sujets sains
A260/A280
1,6 – 2,2 (généralement 1,9 – 2,1)
Volume d’élution
60 µL ou 40 μL
Capacité théorique de liaison
200 μg
Septembre 2023 / Rév. 01
7
ARN de sang stabilisé
Tableau 1: Résumé des spécifications du kit
Temps de préparation
55 min pour 6 préparations
Le kit NucleoSpin® Dx RNA Blood fonctionne selon un mode opératoire qui permet d’utiliser
une solution de 1,2 mL de sang stabilisé provenant d’un tube S-Monovette® RNA Exact de
Sarstedt.
L’ARN isolé peut être utilisé comme matrice dans l’analyse des réactions (q)RT-PCR et du
séquençage de l’ARN. Généralement, une matrice pour la RT-PCR peut être obtenue à partir
d’un volume de 1 à 4 µL d’un éluat de 60 µL provenant d’une préparation.
2.5
Performances analytiques et cliniques
La performance analytique du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood a été évaluée en aval par
quantification de l’ARN extrait.
La répétabilité intracycle du rendement a été calculée à partir de 12 cycles de préparations
indépendants comptant 6 préparations chacun, pour lesquels l’ARN a été quantifié par
spectrophotométrie et/ou fluorimétrie. Le coefficient de variation moyen (CV) du rendement de
l’ARN était de 11 % (6 – 20 %) sur un cycle.
La variation inter-cycles du rendement de l’ARN a été déterminée en comparant le rendement
de l’ARN de deux cycles comportant chacun 6 préparations. La différence entre les rendements
moyens de l’ARN des deux analyses était de 2 %.
La répétabilité inter-lots a été déterminée en comparant le rendement de l’ARN de trois lots
comportant chacun 6 préparations. Le rendement moyen entre les lots différait de 1 à 3 %.
La reproductibilité inter-opérateurs a été déterminée par comparaison du rendement de l’ARN
obtenu par deux opérateurs ayant analysé chacun six préparations. La différence entre les
rendements moyens de l’ARN était de 35 % entre les opérateurs.
Dans une étude portant sur les déficiences dans la réponse au stress cellulaire, l’épissage
différentiel des transcrits du gène XBP1 a été étudié. L’ARN a été isolé à partir de sang humain
prélevé dans le tube Monovette® RNA Exact de SARSTEDT. Deux échantillons de sang ont
été prélevés à intervalles rapprochés chez 3 donneurs, puis conservés pendant 2 heures ou
24 heures avant extraction de l’ARN à l’aide du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood. La quantité et
la qualité de l’ARN ont été déterminées, puis une analyse qRT-PCR a été pratiquée sur quatre
transcrits (deux gènes domestiques (ACTB, HPRT) et deux variants d’épissage de XBP1).
8
Septembre 2023 / Rév. 01
ARN de sang stabilisé
Tableau 2: Rendement et qualité de l’ARN après extraction de l’ARN à partir d’un
tube Monovette® RNA Exact de SARSTEDT. 1, 2, 3 représentent les
donneurs ; A et B représentent les doublons de 2 tubes de prélèvement
sanguin. L’ARN a été extrait 2 h (I) et 24 h (II) après le prélèvement
sanguin. L’ARN a été analysé avec des instruments NanoDrop™ et Qubit.
Échantillon
1A - I
1A - II
2A - I
2A - II
3A - I
3A - II
1B - I
1B - II
2B - I
2B - II
3B - I
3B - II
Ø
Rendement moyen
d’ARN total (volume
d’élution de 40 µL)
ng / ​µL
45,2
46,5
50,4
52,0
55,3
54,4
44,0
42,6
53,0
50,9
50,3
54,1
49,9
2,5 µg
NanoDrop
260 / ​280
2,08
2,08
2,05
2,06
2,02
2,03
2,03
2,07
2,00
2,04
2,04
2,02
2,0
1A-I 1A-II 2A-I 2A-II 3A-I 3A-II 1B-I 1B-II 2B-I 2B-II 3B-I 3B-II
260 / ​230
1,94
1,35
1,77
1,04
1,31
1,68
1,66
1,63
1,06
1,72
1,20
1,73
1,5
Qubit
ng / ​µL
44,9
46,7
47,2
52,9
52,4
50,8
41,4
40,1
49,9
50,8
50,1
52,6
48,3
2,4 µg
[bp/nt]
- 6000
- 4000
- 2000
- 1000
- 500
- 200
- 25
RINe 7.7 8.4 8.4 8.5 8.4
8.5 8.7 8.7 8.7 8.7 8.5 8.5
Figure 1 Détermination de l’intégrité de l’ARN (RINe = RNA Integrity Number, score d’intégrité
de l’ARN obtenu à l’aide du système RNA ScreenTape®). Un RINe moyen de 8,5 a
été obtenu. Les échantillons de gauche à droite représentent les échantillons du
Tableau 2 (1A-I à 3B-II).
Septembre 2023 / Rév. 01
9
ARN de sang stabilisé
XBP spliced / unspliced
XBP splicing ratio
1.30
1.26
1.22
1.21
1.19
1.18
1.21
1.14
1.10
Donor 1
Donor 2
Donor 3
Figure 2 Analyse des variants d’épissage XBP1 (épissés/non épissés) par qRT-PCR
provenant de trois donneurs sains.
Conclusions
Au total, douze extractions d’ARN ont été réalisées à l’aide des tubes de prélèvement sanguin
Monovette® RNA Exact et du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood. Tous les échantillons ont permis
d’obtenir un ARN approprié pour effectuer ensuite une analyse qRT-PCR.
Une comparaison du rapport entre les transcrits d’ARN épissés et non épissés dérivés du
gène XBP1 a révélé des différences mineures entre les trois donneurs, comme illustré sur la
figure ci-dessus.
Les écarts-types illustrés par donneur, représentés par les barres grises, englobent les réplicats
techniques à deux niveaux : premièrement, les différents prélèvements sanguins consécutifs, et
deuxièmement, le temps de conservation (2 et 24 heures) du tube de prélèvement. Les résultats
d’analyse soulignent la capacité de détecter de légères différences en termes de niveaux de
stress cellulaire, y compris au sein de la cohorte de trois donneurs sains.
La littérature existante souligne que les patients présentant des réponses aberrantes en matière
de stress cellulaire ont tendance à avoir des rapports épissés/non épissés allant de 0,5 à
1,5. Dans ce contexte, il apparaît clairement que les procédures de prélèvement sanguin, de
conservation et d’extraction de l’ARN démontrent une robustesse et une précision suffisantes
pour l’examen des individus atteints de troubles de la réponse au stress cellulaire.
L’utilisation diagnostique in vitro des kits NucleoSpin® RNA Blood associés au tube
S-Monovette® RNA Exact est illustrée dans les publications suivantes
•
Linden J et al. (2020) : Impact of RNA Stabilizing Blood Collection Tubes on Gene
Expression Data Validity – A Comparison of S-Monovette® RNA Exact, PAXgene™ Blood
RNA Tubes & Tempus™ Blood RNA Tubes. https ://www.sarstedt.com/fileadmin/user_
upload/Mediacenter/Studien/an_007_rna-exact_monovette_0123.pdf
•
Reith M. et al. (2022) : Novel, Apparently Silent Variant in MFSD8 Causes Neuronal
Ceroid Lipofuscinosis with Marked Intrafamilial Variability. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 2271.
https ://doi.org / ​10.3390/ijms23042271.
2.6
Manipulation, préparation et conservation des
équipements indispensables
Le kit NucleoSpin® Dx RNA Blood est conçu pour extraire l’ARN total à partir de sang prélevé
dans un tube S-Monovette® RNA Exact de Sarstedt.
10
Septembre 2023 / Rév. 01
ARN de sang stabilisé
Le sang doit être prélevé dans le tube S-Monovette® RNA Exact de Sarstedt conformément
au manuel d’instructions du tube S-Monovette® RNA Exact. Les conditions de transport et de
conservation recommandées du tube S-Monovette® RNA Exact s’appliquent également après
le prélèvement sanguin. L’efficacité de la stabilisation de l’ARN dans les tubes S-Monovette®
RNA Exact est validée pendant 5 jours à 22 °C et 14 jours à 8 °C. Pour une conservation à long
terme, la congélation à une température inférieure à -40 °C est possible mais une température
de conservation à long terme à -80 °C est recommandée.
Pour plus de détails, consulter : https ://www.sarstedt.com/produkte/diagnostik/venenblut/smonovette/produkt/01.2048.001/
Porter des gants à tout moment pendant la préparation. Changer fréquemment de gants.
2.7
Procédures d’élution
Il est possible d’ajuster le volume d’élution de 60 µL (volume d’élution standard) et de passer à
40 µL, ce qui entraîne une concentration d’ARN légèrement plus élevée.
L’ARN élué doit être immédiatement placé et conservé sur de la glace pour une stabilité optimale
et pour empêcher les RNases omniprésentes (matériel de laboratoire, doigts, poussière) de
dégrader l’ARN. Pour la conservation à court terme, congeler à -20 °C ; pour la conservation à
long terme, congeler à -70 °C ou à une température inférieure.
Septembre 2023 / Rév. 01
11
ARN de sang stabilisé
3
Conditions de conservation et préparation des
solutions de travail
Attention : Les tampons RB2 et MDB contiennent des sels chaotropiques. Porter des gants et
des lunettes de protection.
ATTENTION : Les tampons RB2 et MDB contiennent des sels de guanidinium qui peuvent
former des composés très réactifs en présence d’eau de Javel (hypochlorite de sodium). Ne
PAS verser d’eau de Javel ni de solutions acides directement dans les déchets issus de la
préparation des échantillons.
Attention :
•
À réception, vérifier l’état des différents composants du kit. Si les flacons de tampon ou
les sachets blister sont endommagés, contacter l’assistance technique et le service client
de MACHEREY‑NAGEL, ou votre revendeur habituel.
•
Ne pas utiliser les composants du kit s’ils sont endommagés.
•
La rDNase lyophilisée est expédiée à température ambiante dans le kit. Conserver la
rDNase lyophilisée (exempte de RNase) à 4 °C à l’arrivée (stable jusqu’à : voir la mention
sur l’emballage).
•
Tous les autres composants du kit doivent être conservés à une température comprise
entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir la mention sur l’emballage. Le conservation
à des températures inférieures peut provoquer la précipitation de sels.
•
Les colonnes NucleoSpin® RNA Blood peuvent être utilisées jusqu’à la date d’expiration
indiquée sur l’emballage du kit.
•
Après la première utilisation, conserver la protéinase K liquide à 4 °C ou à -20 °C.
•
Vérifier que de l’éthanol à 96 – 100 % est disponible comme solution supplémentaire pour
préparer le tampon de lavage RB3.
Avant de débuter un quelconque mode opératoire NucleoSpin® Dx RNA Blood, préparer les
éléments suivants :
•
rDNase (sans RNase) : Ajouter le volume indiqué de tampon de réaction pour la
rDNase (voir tableau ci-dessous) au flacon de rDNase et laisser incuber pendant 1 min
à température ambiante. Agiter doucement les flacons pour dissoudre complètement la
rDNase. Veiller à ne pas mélanger énergiquement la rDNase car celle-ci est sensible à
l’agitation mécanique. Répartir en aliquotes et conserver à -20 °C. La solution de travail
congelée est stable pendant 6 mois. Ne pas congeler/décongeler les aliquotes plus de
trois fois. (Ouvrir le flacon avec précaution car des particules du lyophilisat peuvent être
fixées sur le couvercle.)
•
Tampon de lavage RB3 : Ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % (voir tableau
ci-dessous) au concentré de tampon RB3. Indiquer sur l’étiquette du flacon que de
l’éthanol a été ajouté. Conserver le tampon de lavage RB3 entre 15 et 25 °C jusqu’à un
an.
NucleoSpin® Dx RNA Blood
REF
Concentré de tampon de
lavage RB3
12
50 préparations
740201.50
12 mL
Ajouter 48 mL d’éthanol
Septembre 2023 / Rév. 01
ARN de sang stabilisé
NucleoSpin® Dx RNA Blood
rDNase, sans RNase (lyophilisée)
2 flacons (taille D)
Ajouter 2,5 mL de tampon de réaction pour rDNase
dans chaque flacon
Septembre 2023 / Rév. 01
13
ARN de sang stabilisé
4
Consignes de sécurité
Lors de l’utilisation du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood, porter des vêtements de protection
appropriés (p. ex. : blouse de laboratoire, gants à usage unique et lunettes de sécurité). Pour
plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) disponibles en ligne sur
http ://www.mn-net.com/msds.
Les déchets produits lors de l’utilisation du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood n’ont pas été
testés pour vérifier la présence de résidus de matières infectieuses. Une contamination des
déchets liquides par des matières infectieuses est fortement improbable en raison de l’action
puissante de dénaturation exercée par le réactif de stabilisation dans le tube S-Monovette®
RNA Exact et du traitement par la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Les
déchets liquides doivent donc être considérés comme infectieux et ils doivent être manipulés et
éliminés conformément aux règles de sécurité en vigueur localement.
4.1
Élimination
Éliminer les matériaux dangereux, infectieux ou contaminés par des agents biologiques d’une
manière sûre et acceptable et conformément à toutes les exigences locales et réglementaires.
14
Septembre 2023 / Rév. 01
NucleoSpin® Dx RNA Blood
5
Extraction d’ARN à partir d’un tube
S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT à l’aide
du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood
La procédure suivante décrit les instructions pour un seul échantillon de sang. Il est cependant
possible de traiter plusieurs échantillons simultanément ; le nombre dépend de la capacité de
la microcentrifugeuse utilisée.
Avant de commencer la procédure :
•
Vérifier que le tampon de lavage RB3 a été préparé conformément aux instructions de la
section 3.
•
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément aux instructions de la section 3.
•
L’intégralité de la procédure doit être effectuée à température ambiante (15 à 25 °C).
•
En règle générale, ne pas mélanger des réactifs et des colonnes de kits ou de lots
différents.
Septembre 2023 / Rév. 01
15
NucleoSpin® Dx RNA Blood
5.1
Mode opératoire résumé
En complément du mode opératoire résumé : Lire attentivement le mode opératoire détaillé
(section 5.2) avant de commencer la procédure.
1
Prendre le tube S-Monovette® RNA Exact contenant le sang
2
Transférer 1,2 mL de solution dans un tube de 2 mL.
3
10 µL de protéinase K
4
Température ambiante pendant 15 min (en agitant)
5
Centrifugation courte pour nettoyer le couvercle
6
Charger 600 µL de lysat sur la colonne
7
11 000 x g, 30 s
8
Charger le lysat restant (~600 µL)
9
11 000 x g, 30 s
Dessaler la
membrane en
silice
10
350 µL de tampon MDB
11
11 000 x g, 30 s
Digestion de
l’ADN
12
95 µL de rDNase
13
Température ambiante pendant 15 min
Lavage de la
membrane en
silice
14
200 µL de tampon RB2
15
11 000 x g, 30 s
16
600 µL de tampon RB3
17
11 000 x g, 30 s
18
250 µL de tampon RB3
19
11 000 x g, 2 min
20
Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement (1,5 mL)
21
60 μL de H2O sans RNase
22
11 000 x g, 30 s
Lyse sanguine
Fixation de
l’ADN
Élution de
l’ADN
16
Septembre 2023 / Rév. 01
NucleoSpin® Dx RNA Blood
5.2
Procédure détaillée
1
Prendre le tube S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT (contenant environ 2,4 mL
de sang dans 7,3 mL de solution stabilisante).
2
Prélever 1,2 mL de solution (sang total prélevé dans un tube S-Monovette® RNA
Exact) dans le tube S-Monovette® RNA Exact et transférer dans un tube de lyse (tube
de 2 mL avec couvercle, fourni).
3
Ajouter 10 μL de protéinase K liquide.
4
Incuber 15 min à température ambiante en agitant vigoureusement le tube.
Il est également possible de vortexer vigoureusement pendant 30 s avant d’incuber
sans agitation.
5
Centrifugation courte pour nettoyer le couvercle.
6
Appliquer 600 μL de lysat sur la colonne NucleoSpin® RNA Blood placée dans un
tube de prélèvement (fourni). Il est possible que le lysat commence à s’écouler à
travers la colonne ; ceci n’est pas un problème.
Note : Ne pas pipeter plus de 650 μL dans la colonne à centrifuger, sous peine de
débordement ! Éviter la formation de mousse et d’aérosols. Éviter de mouiller le bord
de la colonne.
7
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Éliminer le tube de prélèvement et le liquide qu’il contient. Placer la colonne dans un
nouveau tube de prélèvement (2 mL ; fourni).
8
Appliquer le lysat restant (environ 600 μL) sur la minicolonne NucleoSpin® RNA
Blood.
9
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Éliminer le tube de prélèvement et le liquide qu’il contient. Placer la colonne dans un
nouveau tube de prélèvement (2 mL ; fourni).
10
Ajouter 350 μL de tampon MDB (tampon de dessalage de la membrane) sur la
colonne.
11
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Note : Après centrifugation, la colonne peut rester dans le tube de prélèvement (avec
le liquide qu’il contient). Le liquide excédentaire peut être légèrement brun, et peut
demeurer dans le tube sans que cela ne perturbe la digestion de l’ADN.
12
Ajouter 95 μL de rDNase sur la colonne.
13
Incuber à température ambiante pendant 15 min.
Note : La centrifugation après incubation n’est pas nécessaire.
14
Ajouter 200 µL de tampon RB2 dans la colonne NucleoSpin® Dx RNA Blood.
Note : Le tampon RB2 désactive la rDNase.
Septembre 2023 / Rév. 01
17
NucleoSpin® Dx RNA Blood
15
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Éliminer le tube de prélèvement et le liquide qu’il contient, et placer la colonne dans un
nouveau tube de prélèvement (2 mL ; fourni).
16
Ajouter 600 µL de tampon RB3 dans la colonne NucleoSpin® RNA Blood.
Note : Vérifier que le tampon résiduel des étapes précédentes est rincé à l’aide du
tampon RB3, en particulier si le lysat a été en contact avec le bord intérieur de la
colonne pendant le dépôt du lysat sur la colonne. Pour un lavage efficace du bord
intérieur, rincer à l’aide de tampon RB3.
17
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
Jeter le liquide excédentaire et placer la colonne dans un nouveau tube de
prélèvement (2 mL ; fourni).
18
Ajouter 250 µL de tampon RB3 dans la colonne NucleoSpin® RNA Blood.
19
Centrifuger pendant 2 min à 11 000 x g.
Au cours de cette étape, l’éthanol est éliminé de la colonne.
Si, pour une raison quelconque, le niveau de liquide dans le tube de prélèvement
a atteint la colonne NucleoSpin® RNA Blood après centrifugation, jeter le liquide et
centrifuger à nouveau.
20
Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement sans nucléase (1,5 mL,
fourni) et éliminer le tube de prélèvement ainsi que le liquide de l’étape précédente.
21
Ajouter 60 μL de H₂O sans RNase (fourni) sur la colonne.
Note : L’élution peut aussi être effectuée avec 40 µL.
22
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
L’ARN est élué dans le tube de prélèvement.
18
Septembre 2023 / Rév. 01
ARN de sang stabilisé
6
Annexe
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Cause possible et suggestions
Contamination par la RNase
L’ARN est
dégradé / ​
aucun ARN
n’est obtenu
•
Créer un environnement de travail sans RNase. Porter des gants
pendant toutes les étapes de la procédure. Changer fréquemment
de gants. Il est recommandé d’utiliser des tubes stériles et jetables
en polypropylène. Conserver les tubes fermés autant que possible
pendant la préparation. La verrerie doit être passée au four pendant
au moins 2 heures à 250 °C avant utilisation.
Les réactifs ne sont pas utilisés ou conservés correctement.
•
Les réactifs ne sont pas conservés correctement. Ajouter le volume
d’éthanol indiqué au concentré de tampon RB3 et mélanger.
Reconstituer et conserver la rDNase lyophilisée conformément aux
instructions de la section 3.
•
L’échantillon et les réactifs n’ont pas été complètement mélangés.
Toujours vortexer vigoureusement après chaque ajout de réactif.
Conservation du kit
Faible qualité
ou rendement
de l’ARN
•
Conserver la rDNase lyophilisée/reconstituée conformément aux
instructions de la section 3.
•
Conserver les autres composants du kit à température ambiante. La
conservation à basse température peut entraîner la précipitation de
sels.
•
Conserver les flacons bien fermés afin d’éviter toute évaporation ou
contamination.
La force ionique et le pH influencent l’absorption A260 ainsi que le
rapport A260/A280
•
Pour mesurer l’absorption de l’ARN extrait, utiliser 5 mm de
tampon Tris de pH 8,5 comme diluant. Voir aussi :
-Manchester, K L. 1995. Value of A260 / ​A280 ratios for measurement of
purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209.
-Wilfinger, W W, Mackey, K and Chomczyski, P. 1997. Effect of pH
and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic
acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481.
Septembre 2023 / Rév. 01
19
ARN de sang stabilisé
Problème
Cause possible et suggestions
Matériau échantillonné
•
Colonne
NucleoSpin®
obstruée / ​
faible qualité
ou rendement
de l’ARN
Mauvaise qualité de l’échantillon. S’assurer que le sang est prélevé
dans un tube S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT conformément
aux instructions d’utilisation. Veiller à mélanger le sang à la solution
de stabilisation présente dans le tube S-Monovette® RNA Exact juste
après le prélèvement, conformément aux instructions d’utilisation.
Conditions de lyse/liaison inadaptées
•
Veiller à agiter pendant l’incubation de la lyse selon l’une des deux
options décrites à la section 5.2.4. – il est important pour la procédure
de bien agiter.
rDNase inactive
•
Reconstituer et conserver la rDNase lyophilisée conformément aux
instructions de la section 3.
La solution de DNase n’est pas correctement appliquée
•
Pipeter la solution de rDNase directement au centre de la membrane
de silice.
Nombre élevé de leucocytes
•
Contamination
de l’ARN
par l’ADN
génomique
20
Plus le nombre de leucocytes est élevé, plus le risque de détecter de
l’ADN résiduel dans l’ARN élué est élevé. Pour éviter cela, suivre l’une
des recommandations ci-dessous.
Système de détection de l’ADN trop sensible
•
Le niveau de contamination par l’ADN est sensiblement réduit lors
de la digestion sur colonne par rDNase. Cependant, il n’y a pas
de garantie que l’ARN purifié soit exempt à 100 % d’ADN. Par
conséquent, dans des applications très sensibles, il peut être possible
de détecter encore de l’ADN.
•
La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec :
- le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie
unique < cible mitochondriale < plasmide transfecté dans les cellules
- la diminution de la taille de l’amplicon obtenu par PCR.
•
Utiliser des cibles plus grandes pour la PCR (p. ex. > 500 pb) ou des
amorces couvrant un intron si possible.
Septembre 2023 / Rév. 01
Problème
Cause possible et suggestions
Contamination par l’éthanol ou un sel
•
Ne pas laisser le liquide entrer en contact avec la sortie de la colonne
après le deuxième lavage au tampon RB3. Veiller à centrifuger à la
vitesse correspondante pendant la durée indiquée afin d’éliminer
complètement le tampon éthanol RB3.
Performance
sous-optimale • Vérifier si le tampon RB3 a été équilibré à température ambiante
avant utilisation. Le lavage à basse température réduit l’efficacité de
de l’ARN
l’élimination des sels par le tampon RB3.
dans les
expériences en Conserver correctement l’ARN extrait
aval
• L’ARN élué doit toujours être conservé sur de la glace pour une
stabilité optimale car les RNases omniprésentes à l’état de traces
contaminantes (matériel de laboratoire, doigts, poussière) dégradent
l’ARN. Congeler à -20 °C pour une conservation à court terme, et à
-70 °C pour la conservation à long terme.
Contact :MACHEREY‑NAGEL Allemagne
Tél. : +49 (0) 24 21 969 333
e-mail : support@mn‑net.com
6.2
Exigence de notification
Veuillez noter que le fabricant et l’autorité compétente de l’État membre européen doivent être
avisés immédiatement de tout incident sérieux en rapport avec le produit. Agences en charge
de la matériovigilance en Europe : https ://ec.europa.eu/health/md_sector/contact_en
6.3
Bibliographie générale
Ceylan A et al. (2022) : Evaluation of mRNA Expression Levels of IL-10, IL-12, TGF-β, FOXP3,
IFN in Multiple Sclerosis Patients. Eastern Anatolian Journal of Science Volume VIII, Issue I,
2022, 9 – 14.
Genre F et al. (2020) : Omentin : a biomarker of cardiovascular risk in individuals with axial
spondyloarthritis. Scientific Reports 10 :9636, https ://doi.org/10.1038/s41598‑020‑66816-x
Jennings LJ (2022) : Normalization of NPM1 mutant transcript to the wild-type transcript.
eJHaem. 2022 ;3 :1343 – 1345.
Pulito-Cueto, V. et al. (2022) : Angiogenic T Cells : Potential Biomarkers for the Early Diagnosis
of Interstitial Lung Disease in Autoimmune Diseases?. Biomed-icines 2022, 10, 851. https ://
doi.org/10.3390/biomedicines10040851.
Shimizu T et al. (2022) : Depletion of R270C Mutant p53 in Osteosarcoma Atten-uates Cell
Growth but Does Not Prevent Invasion and Metastasis In Vivo. Cells. 2022, 11, 3614. https ://
doi.org/10.3390/cells11223614.
Van der Sijde (2020) : RNA from stabilized whole blood enables more compre-hensive immune
gene expression profiling compared to RNA from peripheral blood mononuclear cells. PLoS
ONE 15(6) : e0235413. https ://doi.org/10.1371/journal.pone.0235413
Yamagata H et al. (2023) : Interferon signaling and hypercytokinemia-related gene expression in
the blood of antidepressant non-responders. Heliyon 9 (2023) e13059.
Yuksel F et al. (2023) : The phenotypic spectrum of pathogenic ATP1A1 variants expands :
the novel p.P600R substitution causes demyelinating Charcot–Marie–Tooth disease. Journal of
Neurology, https ://doi.org/10.1007/s00415‑023‑11581-w
6.4
Références
Produit
REF
Quantité
740201.50
50
NucleoSpin Dx Blood
740899.50 / ​.250
50 / ​250
NucleoSpin® Dx Virus
740895.50
50
NucleoSpin® Dx Pathogen
744215.4
4 × 96
NucleoSpin® RNA Blood
740200,10 / ​50
10 / ​50
NucleoSpin® RNA Blood Midi
740210.20
20
NucleoSpin® 8 RNA Blood
740220 / ​.5
12 × 8 / ​60 × 8
740225.2 / ​.4
2 × 96 / ​4 × 96
Kits marqués CE-IVD
NucleoSpin® Dx RNA Blood
®
Kits destinés à la recherche
®
NucleoSpin 96 RNA Blood
Pour des informations plus détaillées sur les produits, rendez-vous sur www.mn-net.com.
6.5
6.6
Explication des pictogrammes
Référence
Quantité suffisante pour < n> tests
Identification du lot
Limites de température autorisées
pour le stockage
Fabricant
Utiliser avant
Produits de diagnostic in vitro
Attention : pour plus d’informations,
se reporter au mode d’emploi.
Consulter le mode d’emploi
Ne pas réutiliser
Limites d’utilisation du produit et garantie
Les composants du kit NucleoSpin® Dx RNA Blood sont prévus, développés, conçus et
vendus UNIQUEMENT À DES FINS DE RECHERCHE, à l’exception, toutefois, de toute autre
fonction du produit qui est expressément décrite dans les brochures originales des produits
MACHEREY‑NAGEL.
ARN de sang stabilisé
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doivent toujours porter des VÊTEMENTS DE PROTECTION adéquats. Pour des informations
détaillées, se référer à la fiche de données de sécurité correspondant au produit. Les produits
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DIAGNOSTIC IN VITRO.
TOUT AUTRE PRODUIT NE PORTANT PAS LA MENTION « IVD » N’EST PAS ADAPTÉ À UN
USAGE CLINIQUE (Y COMPRIS À UN USAGE DIAGNOSTIQUE, THÉRAPEUTIQUE ET/OU
PRONOSTIQUE).
Aucune revendication ou déclaration ne peut être utilisée pour identifier un organisme ou
un usage clinique spécifique (y compris pour le diagnostic, le pronostic, le traitement ou les
prélèvements sanguins). Il incombe plutôt à l’utilisateur ou – en cas de revente des produits – au
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BUT OU UN USAGE PARTICULIER, LA QUALITÉ MARCHANDE, L’ÉTAT OU TOUT AUTRE
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Septembre 2023 / Rév. 01
23
ARN de sang stabilisé
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consécutif ou particulier (y compris la perte d’utilisation, de revenus ou de profits), fondées
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