NucleoSpin RNA, Mini kit | Macherey-Nagel NucleoSpin RNA Midi kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Extraction des ARN
n NucleoSpin® RNA
n NucleoSpin® RNA Midi
November 2023 / Rev. 22
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Extraction d’ARN
Résumé du protocole (Rev. 22)
Mini
Midi
NucleoSpin RNA
NucleoSpin® RNA Midi
®
1
Préparation de
l’échantillon
2
Lyse des cellules
3
Filtration du lysat
30 mg
100 mg
350 μL RA1
3.5 μL μL ß-mercaptoethanol
1.8 mL RA1
18 μL μL ß-mercaptoethanol
Mélanger
Mélanger
11,000 x g,
1 min
4
5
6
7
8
Ajustement des
conditions de fixation des ARN
1,8 mL éthanol 70 %
Mélanger
Mélanger
Charger le lysat
Charger le lysat
11,000 x g,
30 s
4,500 x g,
3 min
350 μL MDB
2,2 mL MDB
11,000 x g,
1 min
4,500 x g,
3 min
95 μL de mélange
réactionnel de rDNase
250 μL de mélange
réactionnel de rDNase
TA, 15 min
TA, 15 min
Dessalage de la
membrane de
silice
Lavage et séchage
de la membrane
de silice
1er lavage
200 μL RAW2
1er lavage
2.6 mL RAW2
2ième lavage
600 μL RA3
2ième lavage
2.6 mL RA3
lavage
250 μL RA3
3
lavage
2.6 mL RA3
3
9
350 μL éthanol 70 %
Fixation de l’ARN
Digestion de l’ADN
Elution d’ARN
purifié
4,500 x g,
10 min
ième
ième
1er et
2ième
11,000 x g,
30 s
1 et
2ième
4,500 x g,
3 min
3ième
11,000 x g,
2 min
3ième
4,500 x g,
5 min
er
60 μL RNasefree H₂O
11,000 x g,
1 min
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com
500 μL RNasefree H₂O
TA, 2 min
4,500 x g,
3 min
Extraction des ARN
Sommaire
1
Composition du kit
1.1 Composants
1.2 Réactifs, consommables et équipements complémentaires requis
1.3 À propos de ce manuel d’utilisation
4
4
6
6
2
Description du produit
2.1 Le principe de base
2.2 Caractéristiques du kit
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
2.4 Procédures d’élution
7
7
8
12
14
3
Conditions de stockage et préparation des solutions de travail
15
4
Instructions de sécurité
4.1 Élimination
17
17
5
Protocoles NucleoSpin® RNA
5.1 Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus
5.2 Préparation d’ARN à partir de 10⁹ ou 30 mg de cellules bactériennes
5.3 Préparation d’ARN à partir de 5 × 10⁷ ou 30 mg de cellules de levure
5.4 Préparation d’ARN à partir de tissus inclus en paraffine*
5.5 Purification de l’ARN de mélanges réactionnels
5.6 Extraction d’ARN à partir d’insectes
18
18
21
23
25
26
27
6
Protocoles NucleoSpin® RNA Midi
6.1 Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus
6.2 Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 5 × 10⁹ cellules bactériennes
6.3 Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 3 × 10⁸ cellules de levure
6.4 Purification de l’ARN de mélanges réactionnels
28
28
32
34
37
7
Protocoles NucleoSpin® RNA / ​NucleoSpin® RNA Midi
38
7.1 Préparation d’ARN à partir d’échantillons traités avec du NucleoProtect® RNA ou
du RNAlater®
38
7.2 Digestion rDNase en solution
38
8
Annexes
8.1 Guide de résolution des problèmes
8.2 Informations pour la commande
8.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
40
40
43
44
3
Extraction des ARN
1
Composition du kit
1.1
Composants
NucleoSpin® RNA
10 préps
740955.10
50 préps
740955.50
250 préps.
740955.250
Tampon de lyse RA1
10 mL
25 mL
125 mL
Tampon de lavage RAW2
13 mL
13 mL
80 mL
Tampon de lavage RA3
(concentré)*
6 mL
12 mL
3 × 25 mL
Tampon de dessalage de la
membrane MDB
10 mL
25 mL
125 mL
Tampon de réaction pour la
rDNase
7 mL
7 mL
30 mL
rDNase, RNase-free
(lyophilisée)*
1 flacon
(taille D)
1 flacon
(taille F)
5 flacons
(taille F)
H2O RNase-free
13 mL
13 mL
60 mL
NucleoSpin® Filters (bagues
violettes)
10
50
250
Colonnes NucleoSpin® RNA
(bagues bleues claires plus tubes collecteurs)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
30
150
750
Tubes d’élution (1,5 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
Composants suite
NucleoSpin® RNA Midi
20 préps.
740962.20
REF
Tampon de lyse RA1
125 mL
Tampon de lavage RAW2
80 mL
Tampon de lavage RA3 (concentré)*
25 mL
Tampon de dessalage des membranes
MDB
50 mL
Tampon de réaction pour la rDNase
7 mL
rDNase, RNase-free (lyophilisée)*
1 flacon (taille D)
H2O RNase-free
13 mL
®
NucleoSpin Filters Midi
(plus tubes collecteurs)
20
Colonnes NucleoSpin® RNA Midi
(plus tubes collecteurs)
20
Tubes collecteurs (15 mL)
20
Manuel d’utilisation
1
* Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
5
Extraction des ARN
1.2
Réactifs, consommables et équipements
complémentaires requis
Réactifs
• Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage RA3)
• Éthanol à 70 % (pour ajuster les conditions de fixation de l’ARN)
• Agent réducteur [ß-mercaptoéthanol, DTT (dithiothreithol) ou TCEP (BisTris (Bis-(2hydroxyéthyl)-imino-tris(hydroxyméthyl)-méthane)] en complément du tampon de lyse
RA1
Consommables
• Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (NucleoSpin® RNA) ou tubes de 15 mL
(NucleoSpin® RNA Midi)
• Cônes stériles, RNases-free
Equipements
• Pipettes manuelles
• NucleoSpin® RNA : centrifugeuse pour microtubes
• NucleoSpin® RNA Midi : centrifugeuse pour tubes de 15 mL avec rotor pivotant et
godets appropriés pouvant atteindre 4 000 – 4 500 × g
• Équipement pour le broyage et l’homogénéisation de l’échantillon (voir paragraphe 2.3)
• Equipements de protection individuelle (par exemple, blouse de laboratoire, gants,
lunettes)
1.3
À propos de ce manuel d’utilisation
Il est fortement recommandé de lire les protocoles détaillés de ce manuel d’utilisation si
le kit NucleoSpin® RNA ou NucleoSpin® RNA Midi est utilisé pour la première fois. Les
utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Celui-ci est
conçu pour repérer aisément le déroulement de la procédure en rappelant la chronologie
des différentes étapes.
Toute la littérature technique est disponible sur notre site www.mn-net.com.
Merci de contacter notre support technique pour toute information concernant les
changements éventuels entre cette version du manuel et les précédentes versions.
6
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
2
Description du produit
2.1
Le principe de base
Un des aspects les plus important lors de l’extraction de l’ARN concerne la prévention
de sa dégradation. Avec les méthodes NucleoSpin® RNA, les cellules sont lysées par
incubation dans une solution contenant une forte concentration d’ions chaotropiques.
Ce tampon de lyse inactive immédiatement les RNases – omniprésentes dans quasiment
tous les échantillons biologiques – et crée les conditions favorables pour la fixation de
l’ARN à la membrane de silice. L’ADN contaminant, également fixé à la membrane de
silice, est éliminé par digestion au moyen d’une solution de rDNase directement appliquée
sur la membrane de silice pendant la procédure (la rDNase RNase-Free est incluse dans le
kit). De simples étapes de lavages avec deux tampons différents permettent d’éliminer les
sels, les métabolites et autres composants cellulaires macromoléculaires. L’ARN purifié
est finalement élué dans de l’H₂O RNases-free (fournie dans le kit).
La préparation de l’ARN avec les kits de la gamme NucleoSpin® RNA peut être effectuée
à TA. Cependant, une fois élué, l’éluat doit être traité avec précaution en raison de sa forte
vulnérabilité vis-à-vis des RNases, souvent présentes sur le matériel, les traces de doigts
et la poussière. Pour garantir la stabilité de l’ARN, conserver le congelé à -20 °C pour un
stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long terme.
Extraction simultanée d’ARN, de protéines et d’ADN (NucleoSpin® RNA/DNA Buffer
Set*, NucleoSpin® TriPrep*)
Le set de tampons ’NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set’ (voir les informations de
commande) est un kit permettant l’extraction d’ARN et d’ADN lorsqu’il est combiné avec
les kits NucleoSpin® RNA, NucleoSpin® RNA XS, NucleoSpin® RNA Plant ou NucleoSpin®
RNA / ​Protein.
Cette technologie brevetée permet l’élution successive de l’ADN et de l’ARN à partir d’une
colonne NucleoSpin® avec un tampon à faible teneur en sel et de l’eau, respectivement.
L’ADN et l’ARN sont immédiatement prêts pour les applications en aval.
La combinaison du kit NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set avec le kit NucleoSpin® RNA / ​
Protein permet d’isoler en parallèle l’ARN, l’ADN et les protéines à partir d’un seul
échantillon sans le diviser.
Le kit NucleoSpin® TriPrep permet l’extraction d’ARN, d’ADN et des protéines à partir
d’échantillons uniques non divisés.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
7
Extraction des ARN
2.2
Caractéristiques du kit
• Les kits NucleoSpin® RNA sont recommandés pour l’extraction d’ARN à partir de
cellules et de tissus cultivés. Des protocoles supports pour la purification d’ARN à partir
de mélanges réactionnels, de bactéries et de levures à l’aide du kit NucleoSpin® RNA
sont également inclus. Les kits NucleoSpin® RNA permettent la purification d’ARN pur
avec un ratio A₂₆₀/A₂₈₀ généralement supérieur à 1,9 (mesuré dans le tampon TE, pH
7,5).
• Même des échantillons biologiques, parfois difficiles à traiter, produisent de l’ARN de
haute qualité. Il s’agit par exemple de tissus de souris (foie, cerveau), de différentes
lignées de cellules tumorales, de Streptocoques et d’Actinobacillus pleuropneumoniae.
• L’ARN purifié est prêt à être utilisé pour des applications telles que la transcriptase
inverse-PCR (RT-PCR), l’extension d’amorces ou les essais de protection par la RNase.
• L’ARN purifié avec les kits NucleoSpin® RNA est d’une grande intégrité. L’indice RIN pour
RNA Integrity Number de l’ARN purifié à partir d’échantillons frais de haute qualité (par
exemple, des cellules eucaryotes ou du foie de souris frais) est généralement supérieur
à 9,0. Toutefois, l’intégrité de l’ARN dépend fortement de la qualité de l’échantillon.
L’intégrité de l’ARN a été examinée à l’aide de la méthode Agilent 2100 Bioanalyzer en
association avec le test RNA 6000 Nano ou Pico.
• La contamination en ADN est considérablement réduite grâce à la digestion avec la rDNase
directement appliquée sur la membrane de silice. Néanmoins, dans des applications très
sensibles, il peut être possible de détecter des traces d’ADN. L’élimination de l’ADN lors
de la digestion sur colonne NucleoSpin® RNA est testée avec la procédure suivante : un
million de cellules HeLa sont soumises à l’extraction d’ARN conformément au protocole.
L’éluat d’ARN est utilisé comme modèle pour la détection par PCR d’un fragment de 1
kb dans une réaction de 30 cycles. En général, aucun fragment PCR n’est obtenu si la
DNase est appliquée, tandis qu’un fragment PCR intense peut être obtenu si la digestion
à la DNase est omise. La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec
1. le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique
< cible plastidiale / ​mitochondriale < plasmide transfecté dans les cellules.
2. la diminution de la taille de l’amplicon PCR.
8
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® RNA
NucleoSpin® RNA Midi
Technologie
Technologie des membranes
de silice
Technologie des membranes
de silice
Utilisation
Réservé uniquement à usage
de la recherche
Réservé uniquement à usage
de la recherche
Format
Mini colonne à centrifuger
Midi colonne à centrifuger
Traitement
Manuel et centrifugation
Manuel et centrifugation
Echantillon
< 5 × 10⁶ cellules en culture,
< 10⁹ cellules de bactéries,
< 10⁸ cellules de levure,
< 30 mg de tissus
< 5 × 10⁷ cellules en culture,
< 10¹⁰ cellules de bactéries,
< 3 × 10⁸ cellules de levure,
< 200 mg de tissus
> 200 nt
> 200 nt
Rendement
14 μg à partir de 10⁶ cellules
HeLa,
70 μg à partir de 10⁹ cellules
de bactéries.
180 μg de 10⁷ cellules HeLa,
620 μg de 4 × 10⁷ cellules
HeLa
A260/A280
1.9 – 2.1
1.9 – 2.1
RIN (RNA integrity
number)
>9
>9
Volume d’élution
40 – 120 μL
500 μL
30 min/6 préparations
80 min/4 préparations
200 μg
700 μg
Taille du fragment
Temps de
préparation
Capacité de reliure
NucleoSpin® RNA
• Le protocole standard (paragraphe 5.1) permet de purifier jusqu’à 70 μg d’ARN par
colonne NucleoSpin® RNA à partir de 5 × 10⁶ cellules en culture ou de 30 mg de
tissus (voir également le tableau 1). L’ARN purifié peut être utilisé comme matrice
dans une réaction RT-PCR. En général, 1 à 10 % de l’éluat d’ARN préparé à partir de
1 × 10⁶ cellules ou 10 mg de tissus suffit comme matrice pour la RT-PCR. Si possible,
il convient de définir des amorces sur des exons qui encadrent un ou plusieurs intron(s)
pour la RT-PCR.
• L’ARN préparé à partir de quantités élevées est généralement exempt d’ADN résiduel,
bien que des traces infimes d’ADN puissent subsister dans la préparation si le matériel
utilisé est riche en acide nucléique. Toutefois, si l’ARN purifié doit être utilisé comme
matrice dans une réaction RT-PCR, nous recommandons d’utiliser des quantités plus
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
9
Extraction des ARN
faibles d’échantillon (par exemple, 1 × 10⁶ cellules en culture ou 10 mg de tissus, ce qui
donne environ 20 μg d’ARN).
• Le kit peut être utilisé pour préparer de l’ARN à partir de différentes quantités
d’échantillons. Pour des résultats optimaux, le volume de tampon de lyse RA1 (étape
1 du protocole) et d’éthanol (étape 3 du protocole) doit être adapté conformément au
Tableau 2.
Tableau 2 : Adaptation de la lyse
Volume de
Quantité
Tampon de lyse
RA1
(étape 2 du
protocole)
Éthanol
(étape 4 du
protocole)
< 5 × 10⁶
350 μL
350 μL
< 20 mg
20 mg – 30 mg*
350 μL
600 μL
350 μL
600 μL
Tissu conservé
dans du
NucleoProtect®
RNA ou RNAlater®.
< 20 mg
20 mg – 30 mg*
350 μL
600 μL
350 μL
600 μL
Échantillons réputés
difficiles à lyser
< 5 × 10⁷*
600 μL
600 μL
Échantillon
Cellules animales
ou humaines
en culture (par
exemple, cellules
HeLa)
Tissu humain ou
animal
Une étape de chargement supplémentaire est nécessaire si 600 μL de tampon RA1 et
d’éthanol sont utilisés (charger l’échantillon sur la colonne en deux étapes de centrifugation
successives).
Selon le type d’échantillon, le rendement moyen est d’environ 5 – 70 μg d’ARN (voir
tableau 3). Le rapport A260/A280 est généralement supérieur à 1,9, ce qui indique la pureté
de l’ARN.
* Le volume de tampon de lyse RA1 inclus dans le kit n’est pas suffisant pour effectuer toutes les préparations
avec 600 μL. Si nécessaire, du tampon de lyse RA1 supplémentaire peut être commandé séparément (voir les
informations de commande, chapitre 8.2).
10
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
Tableau 3 : Aperçu des rendements moyens en ARN obtenus à l’aide du
NucleoSpin® RNA
Échantillon
Rendement moyen
8 × 10⁴ cellules HeLa
1,5 μg
4 × 10⁵ cellules HeLa
4 μg
1 × 10⁶ cellules HeLa
14 μg
2 × 10⁶ cellules HeLa
21 μg
2,5 × 10⁶ cellules HeLa
25 μg
5 × 10⁶ cellules HeLa
50 μg
®
NucleoSpin RNA Midi
• Le kit peut être utilisé pour extraire de l’ARN à partir de différentes quantités
d’échantillons. Pour des résultats optimaux, le volume de tampon de lyse RA1 (étape
1 du protocole) et d’éthanol (étape 3 du protocole) doit être adapté conformément au
tableau 4 :
Tableau 4 : Adaptation de la lyse
Volume de
Quantité
Tampon de lyse
RA1
(étape 1 du
protocole)
Éthanol
(étape 4 du
protocole)
Cellules animales
en culture (par
exemple, cellules
HeLa)
5 × 10⁶ – 2 × 10⁷
2 × 10⁷ – 5 × 10⁷
1,8 mL
3,6 mL
1,8 mL
3,6 mL
Tissu animal
30 – 100 mg
100 – 200 mg
1,8 mL
3,6 mL
1,8 mL
3,6 mL
Bactéries
1 × 10⁹ – 5 × 10⁹
2 × 10⁹ – 1 ×10¹⁰
1,8 mL
3,6 mL
1,8 mL
3,6 mL
Levure
< 3 × 10⁸
3,6 mL
3,6 mL
Échantillon
Une étape de chargement supplémentaire est nécessaire si 3,6 mL de tampon RA1 et
d’éthanol sont utilisés. Si vous isolez l’ARN d’un certain type de tissu pour la première fois
avec le kit NucleoSpin® RNA Midi, nous vous recommandons de commencer avec un
maximum de 100 mg de tissu. En fonction de la nature du tissu, il est possible de traiter
jusqu’à 200 mg. Ne pas utiliser plus de 200 mg de tissu pour éviter le colmatage de la
colonne.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
11
Extraction des ARN
Selon le type d’échantillon, le rendement moyen est d’environ 70 – 400 μg d’ARN (voir
tableau 5). Le rapport A260/A280 indiquant la pureté de l’ARN est généralement supérieur
à 1,9.
Tableau 5 :
Aperçu des rendements moyens en ARN obtenus à l’aide de NucleoSpin® RNA
Midi
Échantillon
Rendement moyen
1 × 10⁶ cellules HeLa
20 μg
1 × 10⁷ cellules HeLa
160 μg
2 × 10⁷ cellules HeLa
330 μg
4 × 10⁷ cellules HeLa
620 μg
200 mg de foie de porc
450 μg
200 mg de foie de souris
320 μg
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
Environnement de travail
Maintenir un environnement de travail exempt de RNase. Porter des gants à tout moment
pendant la préparation. Changer de gants fréquemment
Stockage des échantillons et inhibition de la RNase
Les RNases peuvent dégrader rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ceux-ci
ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la récolte. Les méthodes suivantes
sont recommandées pour éviter la dégradation de l’ARN :
• Utiliser l’échantillon fraîchement récolté pour une lyse immédiate et une extraction de
l’ARN.
• Immerger et conserver les échantillons dans NucleoProtect® RNA ou dans des solutions
de stabilisation similaires. Veiller à ce que l’échantillon soit complètement imprégné de la
solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution de stabilisation
de l’échantillon avant l’isolement de l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la
solution de stabilisation.
• Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la
récolte et le conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois.
Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé.
Veiller à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le
tampon de lyse.
• Conserver les échantillons dans le tampon de lyse RA1 après rupture à -70 °C jusqu’à
un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante pendant quelques heures.
Les échantillons congelés dans le tampon de lyse RA1 doivent être décongelés
lentement avant de commencer l’isolement de l’ARN.
12
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
Broyage et homogénéisation de l’échantillon
• Cellules cultivées en suspension :
Récolter les cellules par centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter immédiatement
le tampon de lyse RA1 conformément à l’étape 2 du protocole standard (voir les
paragraphes 5.1, 6.1).
• Cultures de cellules adhérentes (lyse dans la boîte de culture) :
Aspirer complètement le milieu de culture. Ajouter immédiatement le tampon de
lyse RA1 dans la boîte de culture. Éliminer complètement le milieu de culture afin de
permettre une activité de lyse complète du tampon de lyse. Poursuivre la filtration du
lysat (étape 3 du protocole standard).
• Cultures de cellules adhérentes (lyse après trypsinisation) :
Aspirer le milieu de culture et laver les cellules une fois avec du PBS. Aspirer le PBS.
Ajouter 0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber pendant une durée appropriée
pour détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le détachement des cellules,
ajouter du milieu, transférer les cellules dans un tube approprié (non fourni) et les culotter
par centrifugation pendant 5 minutes à 300 × g. Éliminer le surnageant et poursuivre
l’addition du tampon de lyse RA1 au culot cellulaire.
• Tissus d’animaux :
Pour une préparation efficace de l’ARN, il est essentiel que tout l’ARN contenu dans
l’échantillon soit libéré des cellules par broyage et que la viscosité de l’échantillon soit
réduite par homogénéisation. La technique la plus couramment utilisée pour le broyage
des tissus d’animaux est le broyage à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Réduiser
l’échantillon en poudre fine en présence d’azote liquide. Veiller à ce que l’échantillon
ne décongèle pas pendant ou après le broyage ou la pesée et ajouter la poudre
congelée à une aliquote appropriée de tampon RA1 contenant un agent réducteur
(par exemple, ß-mercaptoéthanol, DTT ou TCEP) et mélanger immédiatement. Le tissu
fragmenté doit ensuite être homogénéisé à l’aide d’un NucleoSpin® Filter / ​Filter Midi
(inclus dans le kit) ou en passant ≥ 5 fois à travers une aiguille de seringue de 0,9 mm.
La décongélation des tissus non broyés doit se faire exclusivement en présence du
tampon RA1 lors d’un broyage mécanique simultanée, par exemple, avec un broyeur à
rotor-stator. Cela garantit que l’ARN n’est pas dégradé par les RNases avant le début
de la préparation. Le rotor-stator broye et homogénéise simultanément l’échantillon
par cisaillement mécanique de l’ADN en quelques secondes à quelques minutes (le
temps d’homogénéisation dépend de l’échantillon). Veiller à ce que l’extrémité du rotor
soit immergée afin d’éviter la formation d’une mousse excessive. Choisir un broyeur
de taille appropriée (des rotors de 5 à 7 mm de diamètre peuvent être utilisés pour
l’homogénéisation dans des tubes de microcentrifugeuse). Le broyage mécanique
et l’homogénéisation dans le tampon RA1 (par exemple, avec un homogénéisateur
à rotor-stator) sont également recommandées pour les échantillons de tissus stockés
dans des solutions de stabilisation comme NucleoProtect® RNA ou RNAlater®.
• Bactéries et levures :
Une lyse enzymatique ou mécanique est nécessaire dans la plupart des cas. Pour
la lyse enzymatique, les échantillons doivent être incubés avec des solutions de
lysozyme (bactéries) ou de lyticase/zymolase (levures) (voir les protocoles supports aux
paragraphes 5.2 et 5.3). Ce traitement permet de digérer ou au moins d’affaiblir les
parois cellulaires robustes de ces organismes, ce qui est essentiel pour une lyse cellulaire
efficace par le tampon RA1. Pour les micro-organismes dont les parois cellulaires sont
extrêmement résistantes - comme certaines souches bactériennes Gram-positives - il
peut être nécessaire d’optimiser les conditions de traitement avec des enzymes lytiques
ou les conditions de culture. Les cellules de bactéries et de levures peuvent également
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
13
Extraction des ARN
être lysées mécaniquement par broyage avec des billes. Par conséquent, remettre en
suspension le culot cellulaire dans le tampon de lyse RA1, transférer la solution dans
un tube MN Bead Tubes Type B et broyer les échantillons par grâce aux billes (par
exemple, en utilisant le support MN Bead Tube Holder sur un Vortex Genie® 2). Après
la lyse, l’homogénéisation est réalisée à l’aide d’un NucleoSpin® Filter ou par passage
dans une aiguille-seringue.
2.4
Procédures d’élution
Il est possible d’adapter la méthode d’élution et le volume d’eau utilisé à l’application
ultérieure qui nous intéresse. Outre la méthode standard décrite dans les protocoles
individuels (taux de récupération d’environ 70 – 90 %), plusieurs modifications sont
possibles.
• Rendement élevé : effectuer deux étapes d’élution avec le volume indiqué dans le
protocole individuel. Environ 90 à 100 % de l’acide nucléique lié sera élué.
• Rendement et concentration élevés : éluer avec le volume d’élution standard et
appliquer l’éluat une fois de plus sur la colonne pour une nouvelle élution.
L’ARN élué doit être immédiatement placé et toujours conservé sur de la glace pour
une stabilité optimale, car les RNases presque omniprésentes (matériel de laboratoire,
empreintes digitales, poussière) dégradent l’ARN. Pour un stockage à court terme,
congeler vos ARN à -20 °C, pour un stockage à long terme, congeler à -70 °C.
14
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
3
Conditions de stockage et préparation des
solutions de travail
Attention :
Les tampons RA1, RAW2 et MDB contiennent du sel chaotropique. Porter des gants et
des lunettes !
ATTENTION : Les tampons RA1, RAW2 et MDB contiennent des sels chaotropiques
qui peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés à de l’eau de
Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides
directement aux déchets de préparation des échantillons.
• Conserver la rDNase lyophilisée (RNase-free) à 4 °C dès son arrivée au laboratoire
(stable jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage).
• Tous les autres composants du kit doivent être conservés à température ambiante
(15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage. Le stockage à des
températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels.
• Vérifier que de l’éthanol à 70 % est disponible comme solution supplémentaire pour
ajuster les conditions de fixation de l’ARN dans le lysat.
• Vérifier que l’agent réducteur (ß-ME, DTT ou TCEP) est disponible.
Avant de commencer le protocole NucleoSpin® RNA, préparer les éléments suivants :
• rDNase (RNase-free) : Ajouter le volume d’H2O RNase-free indiqué (voir tableau cidessous) dans le flacon de rDNase lyophilisée et incuber pendant 1 minute à température
ambiante. Agiter doucement le flacon pour dissoudre complètement la rDNase. Veiller
à ne pas mélanger la rDNase vigoureusement, l’enzyme étant sensible à l’agitation
mécanique. Distribuer en aliquotes et conserver à -20 °C. La solution de travail congelée
est stable pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler/décongeler les aliquotes plus
de trois fois. (Faire attention lors de l’ouverture du flacon car certaines particules du
lyophilisat peuvent être attachées au couvercle). Pour le stockage temporaire de la
rDNase dissoute au cours d’une journée de travail, toujours la conserver sur la glace.
Dans certains cas, le flacon de rDNase peut sembler vide. Ceci est dû au fait que l’enzyme
lyophilisée colle au septum. Pour éviter la perte de rDNase, veiller à recueillir la rDNase au
fond du flacon avant de retirer le bouchon.
• Tampon de lavage RA3 : ajouter le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % (voir le
tableau de la page suivante) au tampon RA3 concentré. Marquer l’étiquette du flacon
pour indiquer que l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage RA3 peut être conservé
à température ambiante (15 – 25 °C) pendant au moins un an.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
15
Extraction des ARN
NucleoSpin® RNA
10 préps
740955.10
50 préps
740955.50
250 préps.
740955.250
Tampon de lavage
RA3 (concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
3 × 25 mL
Ajouter 100 mL
d’éthanol
à chaque flacon
rDNase, RNase-free
(lyophilisée)
1 flacon (taille D)
Ajouter 120 μL de
H2O RNase-free
1 flacon (taille F)
Ajouter 550 μL de
H2O RNase-free
5 flacons (taille F)
Ajouter 550 μL de
H2O RNase-free
à chaque flacon.
REF
NucleoSpin® RNA Midi
20 préps.
740962.20
REF
Tampon de lavage RA3 (concentré)
25 mL
Ajouter 100 mL d’éthanol
rDNase, RNase-free (lyophilisée)
1 flacon (taille D)
Ajouter 540 μL de H2O RNase-free
16
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
4
Instructions de sécurité
Les composants suivants des kits NucleoSpin® RNA et NucleoSpin® RNA Midi
contiennent des substances dangereuses.
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® RNA, porter des vêtements de protection
appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection).
Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS
disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le thiocyanate de guanidine dans le tampon RA1 et le chlorhydrate de
guanidine dans le tampon RAW2 peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils
sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajouter pas d’eau de Javel ou
de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® RNA n’ont pas été testés pour détecter la
présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du traitement par tampon
de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent,
les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés
et éliminés conformément aux réglementations locales en matière de sécurité.
4.1
Élimination
Éliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par
du matériel biologique d’une manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires
locales.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
17
NucleoSpin® RNA
5
Protocoles NucleoSpin® RNA
5.1
Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus
Avant de débuter la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
1
Préparer l’échantillon
Broyer jusqu’à 30 mg de tissu (pour les quantités
d’échantillons, voir le paragraphe 2.2 ; pour les méthodes
d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3).
Broyer
l’échantillon
Jusqu’à 5 × 10⁶ cellules eucaryotes cultivées peuvent
être collectées par centrifugation et lysées en ajoutant
directement le tampon RA1.
2
Lyser les cellules
Ajouter 350 μL de tampon RA1 et 3,5 μL de
ß-mercaptoéthanol (ß-ME) au culot cellulaire ou au tissu
broyé et agiter vigoureusement au vortex.
Pour les quantités appropriées d’échantillon et de
tampon de lyse, voir le paragraphe 2.2.
+ 350 μL RA1
+ 3,5 μL
ß-ME
Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé
à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de
10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse
RA1.
3
Filtrer le lysat
Réduire la viscosité et clarifier le lysat par filtration à
travers le NucleoSpin® Filter (bague violettte) : placer
le NucleoSpin® Filter dans un tube collecteur (2 mL),
appliquer le mélange et centrifuger pendant 1 minute à
11,000 × g.
Le lysat peut alternativement être passé ≥ 5 fois à travers
une aiguille de 0,9 mm (calibre 20) montée sur une
seringue.
En cas de formation d’un culot visible (en fonction de
la quantité et de la nature de l’échantillon), transférer le
surnageant sans aucun culot formé dans un nouveau
tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni).
Important : pour traiter des quantités plus importantes
de cellules (> 1 × 10⁶) ou de tissus (> 10 mg), le lysat
doit d’abord être homogénéisé à l’aide d’une aiguille de
0,9 mm (calibre 20), puis filtré à l’aide de NucleoSpin®
Filters.
18
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
11,000 × g,
1 min
NucleoSpin® RNA
4
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Eliminer le NucleoSpin® Filter et ajouter 350 μL d’éthanol
(70 %) au lysat homogénéisé et mélanger par pipetage
successif (5 fois).
+ 350 μL
d’éthanol
70 %
Autrement, transférer le filtrat dans un nouveau tube de
1,5 mL (non fourni), ajouter 350 μL d’éthanol (70 %) et
mélanger en vortexant (2 × 5 s).
Mélanger
Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut
devenir visible, ce qui n’affectera pas l’isolement de
l’ARN. Veiller à désagréger ce précipité en mélangeant et
charger l’ensemble sur la colonne comme décrit à l’étape
5. Ne pas centrifuger le lysat après l’ajout de l’éthanol et
avant chargement de la colonne afin d’éviter de culotter
le précipité.
5
Fixer l’ARN
Pour chaque préparation, prendre une colonne
NucleoSpin® RNA (bague bleue) placée dans un tube
collecteur. Mélanger le lysat en pipetant 2 à 3 fois et
charger le lysat dans la colonne. Centrifuger pendant
30 s à 11,000 × g. Placer la colonne dans un nouveau
tube de collecte (2 mL).
Charger le
lysat
11,000 × g,
30 s
La capacité de chargement maximale des colonnes
NucleoSpin® RNA est de 750 μL. Répéter la procédure si
des volumes plus importants doivent être traités.
6
Dessaler la membrane de silice
Ajouter 350 μL de MDB (tampon de tampon de
dessalage de la membrane) et centrifuger à 11,000 × g
pendant 1 min pour sécher la membrane.
L'élimination du sel rend la digestion à la rDNase beaucoup
plus efficace. Si la sortie de la colonne est entrée en
contact avec le filtrat de la colonne pour quelque raison
que ce soit, jeter le filtrat et centrifuger à nouveau pendant
30 s à 11 000 × g.
7
+ 350 μL
MDB
11,000 × g,
1 min
Digérer l’ADN
Préparer le mélange réactionnel pour la rDNase dans
un microtube stérile de 1,5 mL (non fourni) : pour chaque
préparation, ajouter 10 μL de rDNase reconstituée (voir
également le chapitre 3) à 90 μL de tampon de réaction
pour la rDNase. Mélanger en tapotant le tube.
Appliquer 95 μL de mélange réactionnel de rDNase
directement sur le centre de la membrane de silice de
la colonne. Incuber à température ambiante pendant
15 min.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
+ 95 μL
Mélange
réactionnel
rDNase
RT,
15 min
19
NucleoSpin® RNA
8
Laver et sécher la membrane de silice
1er lavage
Ajouter 200 μL de tampon RAW2 à la colonne
NucleoSpin® RNA. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g.
Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (2 mL).
Le tampon RAW2 inactive la rDNase.
+ 200 μL
RAW2
11,000 × g,
30 s
2ième lavage
Ajouter 600 μL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin®
RNA. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Jeter
l’écoulement et replacer la colonne dans le tube collecteur.
Note : S’assurer que le tampon résiduel des étapes
précédentes a été lavé avec le tampon RA3, en particulier
si le lysat a été en contact avec le bord interne de la
colonne pendant le chargement du lysat sur la colonne.
Pour un lavage efficace du bord interne, le rincer avec le
tampon RA3.
3ième lavage
Ajouter 250 μL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin®
RNA. Centrifuger pendant 2 min à 11,000 × g pour
sécher complètement la membrane. Placer la colonne
dans un tube collecteur exempt de nucléase (1,5 mL,
fourni).
+ 600 μL RA3
11,000 × g,
30 s
+ 250 μL RA3
11,000 × g,
2 min
Si, pour une raison quelconque, le niveau de liquide dans
le tube collecteur a atteint la colonne NucleoSpin® RNA
après la centrifugation, jeter le liquide et centrifuger à
nouveau.
9
Eluer l’ARN
Éluer l’ARN dans 60 μL de H2O RNase-free, (fourni) et
centrifuger à 11,000 × g pendant 1 min.
Si des concentrations plus élevées d’ARN sont souhaitées,
l’élution peut être effectuée avec 40 μL. Le rendement
global, cependant, diminuera lors de l’utilisation de
volumes plus petits.
+ 60 μL
RNase-free
H2O
11,000 × g,
1 min
Pour d’autres procédures d’élution alternatives, voir le paragraphe 2.4.
20
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA
5.2
Préparation d’ARN à partir de 10⁹ ou 30 mg de cellules
bactériennes
Réactifs supplémentaires à fournir par l’utilisateur :
• Lysozyme ou
• MN Bead Tubes Type B (voir informations de commande, paragraphe 8.2)
Avant de débuter la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
1
Homogénéiser l’échantillon
Deux protocoles alternatifs sont proposés pour l’homogénéisation des cellules
bactériennes. Les utilisateurs peuvent choisir entre une digestion enzymatique (A)
et une homogénéisation mécanique (B), en fonction de l’équipement du laboratoire
et de leurs préférences personnelles.
A) Homogénéisation par digestion enzymatique
Remettre en suspension le culot de cellules bactériennes (souches Gram négatives,
jusqu’à 10⁹ cellules) dans 100 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ; pH
8) contenant 1 mg/mL de lysozyme en agitant vigoureusement le vortex. Incuber à
37 °C pendant 10 minutes.
Pour la préparation de l’ARN des bactéries Gram-positives, remettre en suspension
les cellules dans 100 μL de TE contenant 2 mg/mL de lysozyme. Il peut être
nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en lysozyme, en
fonction de la souche bactérienne.
Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents
génomiques dans une préparation d’acide nucléique de bactéries par rapport
au matériel eucaryote, il peut être nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de
cellules pour la préparation.
Ajouter 350 μL de tampon RA1 et 3,5 μL de ß-mercaptoéthanol à la suspension
et vortexer vigoureusement.
Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le
paragraphe 2.2.
Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser
une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de
lyse RA1.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
21
NucleoSpin® RNA
B) Homogénéisation à l’aide de tubes à billes MN
Récolter les cellules (jusqu’à environ 30 mg de poids humide) par centrifugation et
éliminer le surnageant.
Ajouter 350 μL de tampon RA1 au culot cellulaire et agiter vigoureusement au
vortex.
Note : Les agents réducteurs tels que le ß-mercaptoéthanol, le DTT ou le TCEP ne
sont pas nécessaires.
Transférer les cellules remises en suspension dans un tube MN Bead Tubes Type B
et fermer le tube.
Broyer sur un MN Bead Tube Holder :
Mettre les tubes de billes MN Bead Tubes Type B horizontalement sur un vortex,
par exemple en les fixant avec du ruban adhésif ou en utilisant un adaptateur spécial
(par exemple, le MN Bead Tube Holder, voir les informations de commande).
Vortexer les échantillons à pleine vitesse et à température ambiante pendant
3 minutes.
Homogénéisation avec un broyeur rotatif:
Il est également possible de placer les tubes MN Bead Tubes Type B dans un
broyeur rotatif et d’effectuer un broyage à 30 Hz pendant 1 minute.
Note : Dans les deux cas, nous recommandons vivement d’optimiser la procédure
de broyage avec les billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en
fonction de votre application et du matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre
entre le rendement et l’intégrité de l’ARN.
Centrifuger le tube MN Bead Tubes Type B pendant 1 minute à 11,000 × g pour
sédimenter les billes.
Récupérer le surnageant (lysat).
Passer à l’étape 3 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe 5.1).
22
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA
5.3
Préparation d’ARN à partir de 5 × 10⁷ ou 30 mg de cellules
de levure
Les réactifs et composants supplémentaires à fournir par l’utilisateur :
• Agent réducteur [ß-mercaptoéthanol, ou DTT (dithiothréithol) ou TCEP (BisTris (Bis-(2hydroxyéthyl)-imino-tris(hydroxyméthyl)-méthane)].
• Sorbitol et lyticase (ou zymolase) pour l’homogénéisation par digestion enzymatique
• MN Bead Tubes Type B et MN Bead Tube Holder ou broyeur rotatif pour l’homogénéisation
mécanique
Avant de débuter la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
1
Homogénéiser l’échantillon
Deux protocoles alternatifs sont proposés pour l’homogénéisation des cellules de
levure. Les utilisateurs peuvent choisir entre une digestion enzymatique (A) ou une
homogénéisation mécanique (B), en fonction de l’équipement du laboratoire et
de leurs préférences personnelles. L’homogénéisation par digestion enzymatique
n’est recommandée que pour les cellules fraîchement récoltées, l’homogénéisation
par rupture mécanique peut également être réalisée avec des culots de levure,
conservés à -70 °C pendant plusieurs mois ou des levures stabilisées avec du
NucleoProtect® RNA (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). Comme
cela dépend fortement de l’organisme utilisé, nous recommandons de comparer à
l’avance le matériel congelé et le matériel frais.
Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents
génomiques dans une préparation d’acide nucléique de levures par rapport à des
cellules cultivées ou à du matériel tissulaire, il peut être nécessaire d’utiliser une
quantité plus faible de cellules pour la préparation.
A) Homogénéisation par digestion enzymatique
Récolter les levures de 2 à 5 mL de culture YPD (5,000 × g ; 10 min). Resuspendre
le culot dans une quantité appropriée de tampon sorbitol / ​lyticase fraîchement
préparé (50 – 100 U de lyticase ou de zymolase dans 1 M de sorbitol / ​100 mM
d’EDTA) et incuber à 30 °C pendant 30 minutes. Concentrer les sphéroplastes
obtenus par centrifugation (1,000 × g ; 10 min).
Eliminer délicatement le surnageant.
Note : Il peut être nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration
en lyticase/zymolase, en fonction de la souche de levure.
Ajouter 350 μL de tampon RA1 et 3,5 μL de ß-mercaptoéthanol et vortexer
vigoureusement pour lyser les sphéroplastes.
Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le
paragraphe 2.2.
Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser
une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de
lyse RA1.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
23
NucleoSpin® RNA
B) Homogénéisation par rupture mécanique
Récolter les cellules de levure (environ 30 mg de poids humide) par centrifugation
et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 350 μL de
tampon de lyse RA1.
Remarque : il n’est pas nécessaire d’utiliser un agent réducteur tel que le
ß-mercaptoéthanol, le DTT ou le TCEP.
Transférer les cellules remises en suspension dans un tube MN Bead Tubes Type
B et fermer le tube.
Utiliser un broyeur rotatif pour homogénéiser l’échantillon :
Agiter les échantillons à 30 Hz pendant 10 secondes.
Broyer les cellules avec un support MN Bead Tube Holder :
Agiter les échantillons dans le support MN Bead Tube Holder pendant 3 minutes à
vitesse maximale et à température ambiante.
Dans les deux cas, nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de
broyage avec les billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en
fonction de votre application et de votre matériel de départ afin d’obtenir un bon
équilibre entre le rendement et l’intégrité de l’ARN.
Centrifuger le tube MN Bead Tubes Type B pendant 1 minute à 11,000 × g pour
sédimenter les billes.
Récupérer le surnageant (lysat).
Passer à l’étape 4 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe 5.1).
24
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA
5.4
Préparation d’ARN à partir de tissus inclus en paraffine*
Réactifs supplémentaires à fournir par l’utilisateur :
• Xylène
Avant de débuter la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
A
Introduire 10 mg de tissu finement haché dans un microtube de 1,5 mL (non fourni).
Ajouter 300 μL de xylène et incuber 5 min avec un mélange constant à température
ambiante.
B
Centrifuger à vitesse maximale (13 000 rpm) pendant 3 minutes pour collecter le
tissu. Jeter le xylène.
C
Répéter les étapes A et B deux fois, pour un total de trois lavages au xylène.
D
Ajouter 300 μL d’éthanol à 96 % dans le tube et incuber 5 min en mélangeant
constamment à température ambiante.
E
Centrifuger à vitesse maximale (13 000 rpm) pendant 3 minutes pour collecter le
tissu. Jeter l’éthanol.
F
Répéter les étapes D et E, pour un total de deux lavages à l’éthanol.
Continuer avec l’étape 1 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe
5.1).
Note : Pour une extraction efficace de l’ARN à partir de tissus fixés à la formaline
et inclus en paraffine, il est recommandé d’utiliser le kit NucleoSpin® totalRNA
FFPE (REF 740982, voir les informations de commande, paragraphe 8.2) ou le kit
NucleoSpin® totalRNA FFPE XS (REF 740969, voir les informations de commande,
paragraphe 8.2).
*Veuiller également vous référer à : Annunziata Gloghini, Barbara Canal, Ulf Klein, Luigino Dal Maso, Tiziana Perin,
Riccardo Dalla-Favera, et Antonino Carbone RT-PCR Analysis of RNA Extracted from Bouin-Fixed and
Paraffin-Embedded Lymphoid Tissues J Mol Diagn 2004 6 : 290 – 296 comme exemple de modification du
protocole support mentionné ci-dessus.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
25
NucleoSpin® RNA
5.5
Purification de l’ARN de mélanges réactionnels
Avant de débuter la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 a été préparé conformément au chapitre 3.
1
Préparer l’échantillon
Ramener à un volume de 100 μL d’échantillon avec de l’H2O RNase-free.
Si différents échantillons dont les volumes varient entre 100 et 200 μL sont purifiés,
les échantillons d’ARN doivent être ramenés par exemple à 200 µL avec de l’H2O
RNase-free pour uniformiser les volumes.
2
Préparer du tampon de lyse-fixation
Préparer un mélange RA1 - éthanol avec un rapport de 1 :1.
Pour chaque échantillon d’ARN de 100 μL, mélanger 300 μL de tampon RA1 et
300 μL d’éthanol (96 – 100 %).
Si plusieurs échantillons sont traités, il est recommandé de préparer un prémix (par
exemple, 2 mL de RA1 + 2 mL d’éthanol à 98 % pour environ 6 préparations de
NucleoSpin® RNA ).
3
Filtrer le lysat
Inutile !
4
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
À chaque échantillon d’ARN de 100 μL, ajouter 600 μL (6 volumes) de mélange
de RA1 - éthanol. Mélanger au vortex.
Si 200 μL d’échantillons d’ARN sont traités, ajouter 1200 μL de mélange RA1éthanol.
La capacité de chargement maximale des colonnes NucleoSpin® RNA est de
750 μL. Répéter la procédure si des volumes plus importants doivent être traités.
Après l’ajout d’éthanol, un léger précipité peut apparaître, ce qui n’affectera pas la
purification de l’ARN. Veiller à bien mélanger et à appliquer l’échantillon sous forme
de solution homogène sur la colonne. Pour la capacité de fixation des colonnes,
voir le tableau 1.
Procéder aux étapes 5, 8 et 9 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe
5.1). Les étapes 6 et 7 des protocoles respectifs peuvent être omises dans ce cas.
Comme produits alternatifs pour la purification de l’ARN, NucleoSpin® RNA Clean
up et NucleoSpin® RNA Clean up XS sont recommandés (voir les informations de
commande, paragraphe 8.2).
26
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA
5.6
1
Extraction d’ARN à partir d’insectes
Prélèvement d’échantillons
Utiliser des échantillons frais, surgelés (-70 °C.) ou stabilisés grâce au NucleoProtect®
RNA* (environ 1 – 10 mg d’insecte).
* Veiller à éliminer l’excès de solution NucleoProtect® RNA de l’échantillon avant de
commencer la procédure d’extraction de l’ARN.
2
Remise en suspension
Ajouter 350 μL de tampon de lyse RA1 sans ß-mercaptoéthanol ni TCEP dans un
tube MN Bead Tubes Type G et ajouter l’échantillon d’insecte.
3
Homogénéisation et lyse
Broyer l’échantillon grâce aux billes à l’aide d’un broyeur Retsch (30 Hz, 1 – 3 min)
ou d’un support MN Bead Tube Holder (pleine vitesse, 10 min).
4
Sédimentation des billes
Retirer les billes d’acier du tube de billes (par exemple à l’aide d’un aimant), récupérer
le lysat et l’appliquer sur le NucleoSpin® Filter (bague violette) conformément à
l’étape 3 du paragraphe 5.1 du manuel d’utilisation.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
27
NucleoSpin® RNA Midi
6
Protocoles NucleoSpin® RNA Midi
6.1
Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus
Avant de débuter la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
• For centrifugation, a centrifuge with a swing-out rotor and appropriate buckets capable
of reaching 4,000 – 4,500 × g is required.
1
Homogénéiser l’échantillon
Broyer jusqu’à 100 mg de tissu (pour les quantités
d’échantillons, voir le paragraphe 2.2 ; pour les méthodes
d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3).
Broyer
l’échantillon
Jusqu’à 5 × 10⁷ cellules eucaryotes cultivées sont
collectées par centrifugation et lysées par addition directe
du tampon RA1.
Pour choisir une quantité appropriée de produit de
départ, voir le chapitre 2.2.
2
Lyse des cellules
Ajouter 1,8 mL de tampon RA1 et 18 μL de
ß-mercaptoéthanol (ß-ME) à l’échantillon broyé dans
un tube à centrifuger de 15 mL (non fourni) et vortexer
vigoureusement (utiliser 3,6 mL de tampon RA1 et
36 μL de ß-mercaptoéthanol pour les grandes quantités
d’échantillons ; voir paragraphe2.2.)
Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé
à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de
10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse
RA1.
28
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
+ 1,8 mLRA1
+ 18 μL ß-ME
NucleoSpin® RNA Midi
3
Filtrer le lysat
Appliquer le lysat sur un NucleoSpin® Filter Midi placé
dans un tube de collecte et centrifuger l’échantillon
pendant 10 minutes à 4 500 × g. Cette étape permet
d’homogénéiser l’échantillon en éliminant le matériel
insoluble résiduel et en réduisant simultanément la
viscosité du lysat.
4,500 × g,
10 min
En cas de formation d’un culot visible (en fonction de
la quantité et de la nature de l’échantillon), transférer le
surnageant sans aucun culot formé dans un nouveau
tube à centrifuger de 15 mL (non fourni).
Si l’on travaille avec de petites quantités de cellules
cultivées (par exemple, < 1 × 10⁷ cellules HeLa), l’étape
3 peut être remplacée par un mélange vigoureux de
l’échantillon.
4
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Jeter le NueoSpin® Filter Midi et ajouter 1,8 mL d’éthanol
(70 %) au lysat dans le tube de collecte et mélanger en
vortexant 2 × 5 s (utiliser 3,6 mL d’éthanol 70 % si l’on
travaille avec de grandes quantités d’échantillons, voir
l’étape 2 et le paragraphe 2.2).
Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut devenir
visible, ce qui n’affectera pas la suite de la procédure.
Bien remettre en suspension les précipités avant de les
charger sur la colonne NucleoSpin® RNA Midi.
5
+ 1.8 mL
d’éthanol
à 70 %
+ 1,8 mL
d’éthanol
à 70
Mélanger
Fixer l’ARN
Charger le mélange lysat-éthanol (maximum 3,8 mL)
sur une colonne NucleoSpin® RNA Midi. Centrifuger
pendant 3 minutes à 4,500 × g.
Charger max.
3,8 mL de
lysat
Si vous travaillez avec de grandes quantités d’échantillons,
appliquez le reste du mélange lysat-éthanol (max. 3,8 mL)
sur la colonne et centrifugez à nouveau.
4,500 × g,
3 min
Si le lysat n’a pas traversé la colonne, centrifuger à
nouveau à 4,500 × g pendant 10 minutes.
En cas de surcharge de la colonne, un écoulement
incomplet de l’échantillon peut être observé, par exemple
si la membrane est encore humide ou si une partie du
lysat n’est pas passée. Retirer le lysat qui n’a pas traversé
la colonne et passer à l’étape suivante du protocole. La
prochaine fois, utiliser moins de matériel de départ et
éliminer soigneusement le matériel insoluble à l’étape 3.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
29
NucleoSpin® RNA Midi
6
Dessaler la membrane de silice
Ajouter 2,2 mL de MDB (Membrane Desalting Buffer) à
la colonne NucleoSpin® RNA Midi. Centrifuger pendant
3 minutes à 4,500 × g. Jeter le filtrat.
Si la membrane de silice n’est pas complètement sèche
après la centrifugation, centrifuger à nouveau à 4,500 × g
pendant 10 minutes. Cette étape permet d’obtenir les
conditions de réaction optimales pour la rDNase.
7
+ 2.2 mL
MDB
4,500 × g,
3 min
Digérer l’ADN
Préparer le mélange réactionnel pour la DNase : dans
un microtube stérile, mélanger 235 μL de tampon de
réaction pour la rDNase et 25 μL de rDNase reconstituée
(voir chapitre 3) par colonne NucleoSpin® RNA Midi.
Mélanger soigneusement mais délicatement.
Digérer avec la rDNase
+ 250 μL
de mélange
réactionnel
rDNase
RT,
15 min
Appliquer 250 μL de mélange réactionnel de rDNase
directement au centre de la membrane de silice. Incuber
à température ambiante pendant 15 minutes.
8
Laver et sécher la membrane de silice
1er lavage
Ajouter 2,6 mL de tampon RAW2 à la colonne
NucleoSpin® RNA Midi. Incuber à température ambiante
pendant 2 minutes. Centrifuger pendant 3 minutes à 4
500 × g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube
collecteur (15 mL).
Le tampon RAW2 inactive la rDNase.
+ 2.6 mL
RAW2
4,500 × g,
3 min
+ 2.6 mL RA3
2ème lavage
Ajouter 2,6 mL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin®
RNA Midi. Centrifuger pendant 3 minutes à 4 500 × g.
4,500 × g,
3 min
Le filtrat ne doit pas être jeté lors de cette étape. Laisser
la colonne NucleoSpin® RNA Midi dans le tube collecteur.
3ème lavage
+ 2.6 mL RA3
®
Ajouter 2,6 mL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin
RNA Midi. Centrifuger pendant 5 minutes à 4 500 × g pour
sécher complètement la membrane. Placer la colonne
dans un nouveau tube de collecte (15 mL, fourni).
30
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
4,500 × g,
5 min
NucleoSpin® RNA Midi
9
Eluer l’ARN
Pipeter 500 μL d’H2O RNase-free (fourni) directement au
centre de la membrane de silice. Incuber à température
ambiante pendant 2 min et centrifuger pendant 3 min à
4 500 × g.
La réduction du volume d’élution n’entraîne généralement
pas une augmentation de la concentration de l’acide
nucléique élué avec le kit NucleoSpin® RNA Midi (voir
paragraphe 2.4 pour les procédures d’élution alternatives).
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
+ 500 μL
RNase-free
H2O
RT,
2 min
4,500 × g,
3 min
31
NucleoSpin® RNA Midi
6.2
Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 5 × 10⁹
cellules bactériennes
Réactif supplémentaire à fournir par l’utilisateur :
• Lysozyme ou
• MN Bead Tubes Type B (voir informations de commande, paragraphe 8.2)
Avant de commencer la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
1
Homogénéiser
A) Homogénéisation par digestion enzymatique
Remettre en suspension le culot de cellules bactériennes (souches Gram négatif)
dans 200 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ; pH 8) contenant
1 mg/mL de lysozyme en vortexant vigoureusement. Incuber à 37 °C pendant
10 minutes.
Pour la préparation de l’ARN des bactéries Gram-positives, remettre en suspension
les cellules dans 200 μL de TE contenant 2 mg/mL de lysozyme. Il peut être
nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en lysozyme, en
fonction de la souche bactérienne.
Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents
génomiques dans une préparation d’acide nucléique de bactéries par rapport
au matériel eucaryote, il peut être nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de
cellules pour la préparation.
Ajouter 1,8 mL de tampon RA1 et 1,8 μL de ß-mercaptoéthanol à la suspension
et vortexer vigoureusement.
Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le
paragraphe 2.2
Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser
une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de
lyse RA1.
B) Homogénéisation par rupture mécanique
Concentrer les cellules par centrifugation et éliminer le surnageant.
Ajouter des billes de verre (par exemple, MN Bead Type B1 (en vrac), 40 – 70 mm
ou MN Bead Type B2 (en vrac), 0,3 – 0,4 mm, voir les informations de commande).
Agiter les échantillons dans un broyeur à 30 Hz pendant 15 minutes.
Remarque : les agents réducteurs tels que le ß-mercaptoéthanol, le DTT et le TCEP
peuvent être dispensés (en fonction de l’échantillon).
Note : Nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de broyage des
billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en fonction de votre
application et de votre matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre entre le
rendement et l’intégrité de l’ARN.
32
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA Midi
1
Filtrer le lysat
Réduire la viscosité et la turbidité de la solution par filtration à travers le NucleoSpin®
Filter Midi. Placer le NucleoSpin® Filter Midi dans un tube collecteur, appliquer le
mélange et centrifuger pendant 10 minutes à 4 500 × g.
En cas de formation d’un culot visible (en fonction de la quantité et de la nature
de l’échantillon), transférer le surnageant sans le culot dans un nouveau tube à
centrifuger de 15 mL (non fourni).
2
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
Ajouter 1,8 mL d’éthanol (70 %) au lysat et mélanger au vortex.
Passer à l’étape 5 du protocole standard NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1).
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
33
NucleoSpin® RNA Midi
6.3
Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 3 × 10⁸
cellules de levure
Les réactifs et composants supplémentaires doivent être fournis par l’utilisateur :
• Agent réducteur [ß-mercaptoéthanol, ou DTT (dithiothréithol), ou TCEP (BisTris (Bis-(2hydroxyéthyl)-imino-tris(hydroxyméthyl)-méthane)].
• Sorbitol et lyticase (ou zymolase) pour l’homogénéisation par digestion enzymatique ou
broyeur et billes de verre pour l’homogénéisation par rupture mécanique.
Avant de commencer la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 3.
34
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA Midi
1
Homogénéiser l’échantillon
Deux protocoles alternatifs sont proposés pour l’homogénéisation des cellules de
levure. Les utilisateurs peuvent choisir entre une digestion enzymatique (A) ou une
homogénéisation mécanique (B), en fonction de l’équipement du laboratoire et de
leurs préférences personnelles. L’homogénéisation par digestion enzymatique n’est
recommandée que pour les cellules fraîchement récoltées. L’homogénéisation par
rupture mécanique peut également être réalisée avec des culots de cellules de
levure, conservés à -70 °C pendant plusieurs mois.
Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents
génomiques dans une préparation d’acide nucléique de levures par rapport à des
cellules cultivées ou à du matériel tissulaire, il peut être nécessaire d’utiliser une
quantité plus faible de cellules pour la préparation.
A) Homogénéisation par digestion enzymatique
Récolter une quantité appropriée de cellules de la culture YPD (5,000 × g ;
10 min). Resuspendre le culot dans une quantité appropriée de tampon sorbitol / ​
lyticase fraîchement préparé (50 – 100 U de lyticase ou de zymolase dans 1 M de
sorbitol / ​100 mM d’EDTA) et incuber à 30 °C pendant 30 minutes. Concentrer les
sphéroblates obtenus par centrifugation (1,000 × g ; 10 min).
Jeter soigneusement le surnageant.
Il peut être nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en
lyticase/zymolase, en fonction de la souche de levure.
Poursuivre avec l’étape 2.
OU
B) Homogénéisation par rupture mécanique
Récolter une quantité appropriée de cellules de la culture YPD (5,000 × g ; 10 min)
et laver avec de l’eau glacée. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un
mélange de 3,6 mL de tampon RA1 et 36 μL de ß-mercaptoéthanol.
Ajouter les billes de broyage (par exemple, MN Bead Type B (en vrac) ou C (en
vrac), voir les informations de commande).
Agiter les échantillons dans un broyeur à 30 Hz pendant 15 minutes.
Passer à l’étape 3 Filtrer le lysat.
Remarque : les agents réducteurs tels que le ß-mercaptoéthanol, le DTT et le TCEP
peuvent être dispensés (en fonction de l’échantillon).
Note : Nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de broyage
des billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en fonction de
votre application et du matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre entre le
rendement et l’intégrité de l’ARN.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
35
NucleoSpin® RNA Midi
2
Lyse des cellules
Ajouter 3,6 mL de tampon RA1 et 36 μL de ß-mercaptoéthanol et vortexer
vigoureusement pour lyser les sphéroplastes.
Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir la
section 2.2.
Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser
une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de
lyse RA1.
3
Filtrat lysat
Réduire la viscosité et la turbidité de la solution par filtration à travers NucleoSpin®
Filter Midi. Placer NucleoSpin® Filter Midi dans les tubes collecteurs et centrifuger
pendant 10 minutes à 4 500 × g.
En cas de formation d’un culot visible (en fonction de la quantité et de la nature
de l’échantillon), transférer le surnageant sans le culot dans un nouveau tube à
centrifuger de 15 mL (non fourni).
4
Ajuster les conditions de fixation des ARN
Jeter le NucleoSpin® Filter Midi et ajouter 3,6 mL d’éthanol à 70 % au lysat dans
le tube collecteur et mélanger au vortex.
Passer à l’étape 5 du protocole standard NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1).
36
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA Midi
6.4
Purification de l’ARN de mélanges réactionnels
Avant de commencer la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 a été préparé conformément au chapitre 3.
1
Préparer l’échantillon
Compléter les échantillons d’ARN < à 500 μL avec de l’H2O RNase-free jusqu’à
500 μL.
2
Préparer le prémix de tampon de lyse et de fixation
Préparer un prémix de tampon RA1 - éthanol avec un rapport de 1 :1.
Pour chaque échantillon d’ARN de 500 μL, mélanger 1500 μL de tampon RA1
et 1500 μL d’éthanol (96 – 100 %).
Si plusieurs échantillons sont traités, il est recommandé de préparer un masterprémix (par exemple, 2 mL de RA1 + 2 mL d’éthanol à 98 % pour environ 6
préparations de NucleoSpin® RNA ).
3
Filtrer le lysat
Inutile !
4
Ajuster les conditions de fixation de l’ARN
À 500 μL d’échantillon d’ARN, ajouter 3000 μL (6 volumes) de premix de
tampon RA1-éthanol. Mélanger l’échantillon avec le prémix par vortex.
La capacité de chargement maximale des colonnes NucleoSpin® RNA Midi est de
4 000 μL. Répéter la procédure si des volumes plus importants doivent être traités.
Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut devenir visible, ce qui n’affectera
pas la purification de l’ARN. Veiller à bien mélanger et à appliquer l’échantillon
sous forme de solution homogène sur la colonne. Pour la capacité de fixation des
colonnes, voir le Tableau 1.
Passer aux étapes 5, 8 et 9 du protocole standard NucleoSpin® RNA Midi
(paragraphe 6.1). Les étapes 6 et 7 des protocoles respectifs peuvent être omises
dans ce cas.
Les produits NucleoSpin® RNA Clean up et NucleoSpin® RNA Clean up XS sont
recommandés comme produits alternatifs pour la purification de l’ARN (voir les
informations de commande).
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
37
NucleoSpin® RNA / NucleoSpin® RNA Midi
7
Protocoles NucleoSpin® RNA / ​NucleoSpin® RNA
Midi
7.1
Préparation d’ARN à partir d’échantillons traités avec du
NucleoProtect® RNA ou du RNAlater®
Avant de commencer la préparation :
• Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au
chapitre 33.
1
Préparer l’échantillon
Retirer la solution NucleoProtect® RNA/RNAlater®. Couper une quantité
appropriée de tissu.
2
Lyse des cellules
Ajouter 350 μL (NucleoSpin® RNA) / ​1,8 mL (NucleoSpin® RNA Midi) de
tampon RA1 et 3,5 μL (NucleoSpin® RNA) / ​18 μL (NucleoSpin® RNA Midi) de
ß-mercaptoéthanol à l’échantillon. Broyer l’échantillon en utilisant, par exemple,
des homogénéisateurs à rotor-stator (pour les méthodes d’homogénéisation,
voir le paragraphe 2.3).
Passer à l’étape 3 (filtrer le lysat) des protocoles standards NucleoSpin® RNA
(paragraphe 5.1) ou NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1).
7.2
Digestion rDNase en solution
La digestion à la rDNase sur colonne dans le protocole standard est très efficace et
produit un minimum d’ADN résiduel. Cet ADN ne sera pas détectable dans la plupart des
applications en aval. Malgré cela, certaines applications requièrent des teneurs en ADN
résiduel encore plus faibles. L’élimination de l’ADN à un niveau totalement indétectable
est un défi et l’efficacité d’une digestion de l’ADN sur colonne n’est parfois pas suffisante
pour les applications en aval exigeant une teneur résiduelle en ADN la plus faible possible.
Un exemple typique d’une application exigeante est la réaction de RT-PCR dans laquelle
les amorces ne font pas la différence entre l’ADNc (dérivé de l’ARN) et l’ADN génomique
contaminant. En particulier, si
• les cibles à nombre de copies élevé sont analysées (par exemple, les cibles multi-familles
de gènes, mitochondriales, plastidiales ou plasmidiques (à partir de transfections)).
• le gène cible a un niveau d’expression très faible
• l’amplicon est relativement petit (< 200 pb).
La digestion de l’ADN en solution peut dégrader efficacement l’ADN contaminant.
Toutefois, un contrôle rigoureux de la RNase et une purification ultérieure de l’ARN (afin
d’éliminer le tampon, les sels, la DNase et l’ADN digéré) sont généralement nécessaires.
La DNase recombinante RNase-free (rDNase) de haute qualité contenue dans les kits
NucleoSpin® RNA facilite cette digestion en solution afin d’éliminer même les traces
d’ADN contaminant.
38
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
NucleoSpin® RNA / NucleoSpin® RNA Midi
A
Digérer l’ADN (Condition réactionnelle)
Ajouter 6 μL de tampon de réaction rDNase et 0,6 μL de rDNase à 60 μL
d’ARN élué.
(Alternativement, prémix 100 μL de tampon de réaction rDNase et 10 μL de
rDNase et ajouter 1/10 de volume à un volume d’éluat d’ARN).
Agiter doucement le tube afin de mélanger la solution. Centrifuger doucement
(environ 1 s à 1,000 × g) pour recueillir toutes les gouttelettes de la solution au
fond du tube.
B
Incuber l’échantillon
Incuber pendant 10 minutes à 37 °C.
C
Repurifier l’ARN
Repurifier l’ARN à l’aide d’une procédure de purification de l’ARN appropriée,
par exemple en utilisant les kits NucleoSpin® RNA Clean up, NucleoSpin® RNA
Clean up XS (voir les informations relatives à la commande), ou par précipitation
à l’éthanol.
Précipitation de l’éthanol, à titre d’exemple :
Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 2,5 volumes
d’éthanol 96 – 100 % à un volume d’échantillon. Mélanger soigneusement.
Incuber quelques minutes à quelques heures à -20 °C ou 4 °C.
Note : Appliquer des temps d’incubation longs si l’échantillon contient une
faible concentration d’ARN. Des temps d’incubation courts sont suffisants si
l’échantillon contient une forte concentration d’ARN.
Centrifuger pendant 10 minutes à vitesse maximale.
Laver le culot d’ARN avec de l’éthanol à 70 %.
Sécher les culots d’ARN et remettre l’ARN en suspension dans du H2O RNasefree.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
39
Extraction des ARN
8
Annexes
8.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possible et suggestions
Contamination par les RNases
ARN dégradé / ​
rendement nul
• Créer un environnement de travail RNase-free. Porter des
gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de
gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes en
polypropylène stériles et jetables. Garder les tubes fermés dans
la mesure du possible pendant la préparation. La verrerie doit
être soumise à un traitement thermique pendant au moins 2
heures à 250 °C avant d’être utilisée.
Mauvaise utilisation ou préparation erronée des réactifs
• Les réactifs n’ont pas été correctement préparés. Ajouter
le volume indiqué d’H2O RNase-free au flacon de rDNase
et d’éthanol 96 % au tampon concentré RA3 et mélanger.
Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée conformément aux
instructions données au chapitre 3.
• L’échantillon et les réactifs ont été mal homogénéisés. Toujours
vortexer vigoureusement après l’ajout de chaque réactif.
• L’éthanol n’a été ajouté après la lyse. La fixation de l’ARN à la
membrane de silice n’est efficace qu’en présence d’éthanol.
Stockage du kit
ARN de
faible qualité / ​
rendement faible
• Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions
données au chapitre 3.
• Stocker les autres composants du kit à température ambiante.
Le stockage à des températures inférieures peut provoquer une
précipitation de sel.
• Garder les flacons bien fermés afin d’éviter l’évaporation ou la
contamination des solutions.
Influence de la force ionique et du pH sur l’absorption A260 sur le
rapport A₂₆₀/A₂₈₀.
• Pour les mesures d’absorption, utiliser 5 mM Tris pH 8,5 comme
diluant. Voir aussi :
- Manchester, K L. 1995. Value of A₂₆₀/A₂₈₀ ratios for measurement
of purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209.
- Wilfinger, W W, Mackey, K et Chomczyski, P. 1997. Effect of
pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of
nucleic acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481.
40
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
Problèmes
Causes possible et suggestions
Echantillon
ARN de
faible qualité / ​
rendement faible
(suite)
• Mauvaises conditions de stockage des échantillons. Dans la
mesure du possible, utiliser du matériel frais. Si ce n’est pas
possible, congeler rapidement les échantillons dans de l’azote
liquide. Les échantillons doivent toujours être conservés à -70 °C.
Ne jamais laisser les tissus décongeler avant l’ajout du tampon
RA1. Effectuer le broyage des échantillons dans de l’azote
liquide. Il est également possible de conserver les tissus dans
du NucleoProtect®RNA ou des réactifs de protection similaires.
• Broyage et/ou homogénéisation insuffisante de l’échantillon.
Veiller à ce que l’échantillon soit bien broyé et utiliser les filtres
NucleoSpin® Filters / ​Filters Midi pour faciliter l’homogénéisation
du lysat.
Contamination par du thiocyanate de guanidinium
Faible ratio A260 / ​
A230
• Déposer soigneusement le lysat sur la colonne NucleoSpin® RNA
et essayer d’éviter toute contamination de la partie supérieure de
la colonne et de son couvercle.
• S’assurer qu’une quantité / ​
concentration suffisante d’ARN
est utilisée pour la quantification afin que la valeur A230 soit
significativement plus élevée que la ligne de base.
Echantillons
• Quantité excessive de matériel initial. Une surcharge peut
entraîner une diminution du rendement global. Réduire la
Colonne
quantité d’échantillon de départ ou utiliser un plus grand volume
NucleoSpin® RNA
colmatée / ​
de tampon RA1.
faible rendement
• Broyage et/ou homogénéisation insuffisante de l’échantillon.
et/ou qualité
Veiller à ce que l’échantillon soit bien broyé et utiliser les filtres
NucleoSpin® Filters / ​Filters Midi pour faciliter l’homogénéisation
du lysat.
rDNase inactive
• Reconstituer et conserver la rDNase lyophilisée selon les
instructions données au chapitre 3.
Contamination de
l’ARN par l’ADN
génomique
Solution de rDNase mal appliquée
• Déposer la solution de rDNase directement au centre de la
membrane de silice.
Trop d’échantillon de départ
• Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisés.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
41
Extraction des ARN
Problèmes
Causes possible et suggestions
Système de détection de l’ADN trop sensible
• La contamination en ADN est efficacement réduite par la
digestion à la rDNase effectuée sur la membrane. Cependant,
il est difficile de garantir l’élimination complète de l’ADN et, pour
des applications très sensibles, il peut parfois s’avérer que de
l’ADN résiduel soit détecté.
Contamination de
l’ARN par l’ADN
génomique (suite)
• Le système NucleoSpin® RNA est vérifié par la procédure
suivante : un million de cellules HeLa sont soumises à l’extraction
d’ARN conformément au protocole. L’éluat d’ARN est utilisé
comme modèle pour la détection par PCR d’un fragment de 1 kb
dans une réaction de 30 cycles. En général, aucun produit PCR
n’est obtenu, tandis que l’omission de la digestion par la rDNase
conduit habituellement à des résultats PCR positifs.
• La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec :
- le nombre de copies d’ADN par préparation : cible monocopie
< cible plastidiale / ​mitochondriale < plasmide transfecté dans les
cellules
- diminution de la taille de l’amplicon PCR.
• Utiliser des cibles de PCR plus grandes (par exemple, > 500 pb)
ou des amorces couvrant des introns si possible.
• Utiliser le protocole de support 7.2 pour une digestion
complémentaire en solution avec de la rDNase.
Contamination par de l’éthanol ou des sels
• Ne pas laisser l’embout de sortie de la colonne entrer en contact
avec le filtrat après le second lavage avec le tampon RA3. Veiller
à centrifuger à la vitesse et pendant la durée recommandée afin
d’éliminer totalement le tampon éthanolique RA3.
Performance
suboptimale
de l’ARN dans
les applications
avales
• Vérifier que le tampon RA3 a été équilibré à la température
ambiante avant de l’utiliser. Le lavage à des températures plus
basses réduit l’efficacité de dessalage par le tampon RA3.
Stocker correctement l’ARN isolé
• L’ARN élué doit être conservé sur la glace pour garantir sa stabilité
en raison de l’omniprésence des traces de RNases (matériel
du laboratoire, traces de doigts, poussières) susceptibles de
dégrader l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, stocker
à -20 °C et à -70 °C pour une conservation à long terme.
42
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Extraction des ARN
8.2
Informations pour la commande
Produit
REF
Paquet de
NucleoSpin RNA
740955.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin® RNA Midi
740962.20
20
NucleoSpin miRNA
740971.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin® ARN / ​Protein
740933.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin® TriPrep
740966.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin RNA Clean up
(purification de l’ARN)
740948.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin® RNA XS
740902.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin RNA Clean up XS
740903.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set
740944
Convient pour 100
préparations
Tampon RA1
740961 / ​.500
60 / ​500 mL
Set rDNase
740963
1 set
740395.107
107 mg
NucleoProtect RNA
740400.50 / ​.250
50 / ​250 / ​500
MN Bead Tubes Type B
740812.50
50
MN Bead Type B1 (en vrac)
40 – 70 mm billes de verre
740809.B.5000
750 g
MN Bead Type B2 (Bulk)
0.3 – 0.4 mm billes de verre
740812.B.1000
750 g
MN Bead Tubes Type C
740813.50
50
MN Bead Type C (en vrac)
Billes de corindum de 1 mm
740813.B.250
200 g
MN Bead Tube Holder pour tubes
de billes
740469
1
NucleoSpin® Filters
740606
50
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
®
®
®
®
TCEP
®
Visitez notre site www.mn-net.com pour plus d’informations sur nos produits
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
43
Extraction des ARN
8.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode
d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du
produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du
produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et
descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants
de MACHEREY NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par
un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et
elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la
société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les
descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre
d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
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Tel. : +49 24 21 969 333
support@mn-net.com
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Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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