remel Wellcolex* Colour Shigella Mode d'emploi

S’il est nécessaire de confirmer les résultats du test, la suspension
bactérienne utilisée pour le test coloré peut être remise en
culture pour identification ultérieure ; la même suspension peut
également être utilisée pour l’analyse avec le test Wellcolex*
Colour Salmonella (ZC50/R30858301).
8. Procedure
MATERIEL FOURNI
Le test Wellcolex* Colour Shigella ZC51/R30858401 contient
suffisamment de réactifs pour la réalisation de 50 tests. Voir la
section Contenu du coffret.
MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI
1.
Sérum physiologique stérile à 0,85%.
2.
Le test doit être réalisé à l’aide l’un agitateur rotatif plan
dont le diamètre orbital est égal à 38 mm (1,5 in)/32 mm
(1,25 in) et la vitesse de fonctionnement à environ 150 tr/
mn. La vitesse et le diamètre de rotation sont essentiels
à la bonne réalisation du test.
Aucun autre matériel ou équipement n’est nécessaire.
PROCEDURE DU TEST
ATTENTION : Prendre toutes les précautions requises pour la
manipulation de cultures vivantes au cours du test.
Identification des colonies
Etape 1Distribuer environ 200 µl de sérum physiologique dans un
tube à suspension. Il est possible d’utiliser le distributeur
d’échantillon jetable qui est gradué à environ 200 µl.
Etape 2Après une nuit de culture, prélever de la plaque de
culture, 1 ou 2 colonies de taille moyenne (1 à 2 mm)
présumées de Shigella avec l’extrémité plate du bâtonnet
d’échantillonnage, et les mettre en suspension avec
précaution dans le sérum physiologique. Si les colonies sont
petites, en prélever davantage ; recouvrir l’extrémité du
bâtonnet d’échantillonnage. Jeter le bâtonnet selon les règles
de sécurité appropriées.
Etape 3Remettre en suspension les réactifs latex 1 et 2 en les agitant
vigoureusement pendant quelques secondes. Le flacon tenu
verticalement, distribuer une goutte de chacun des réactifs
latex dans un cercle différent de la carte de réaction posée à
plat. Eliminer les bulles d’air avec l’extrémité du bâtonnet.
Etape 4A l’aide d’un distributeur d’échantillon jetable tenu
verticalement, laisser tomber d’elle-même une goutte (40 µl)
de suspension bactérienne dans chacun des 2 cercles. Eviter la
formation de bulles d’air. Jeter le distributeur selon les règles
de sécurité appropriées.
Etape 5A l’aide d’un bâtonnet d’échantillonnage, mélanger le contenu
de chaque cercle en l’étalant sur toute la surface du cercle. Le
même bâtonnet peut être utilisé pour les 2 cercles ; le jeter
ensuite selon les règles de sécurité appropriées.
Etape 6Placer la carte sur un agitateur rotatif sur plateau et agiter
pendant 2 minutes à 150 ± 5 tr/mn (voir le paragraphe
« Précautions d’analyse »). Eteindre l’appareil et observer
l’apparition éventuelle d’une agglutination sans retirer la
carte de l’agitateur. La carte doit être observée directement
du dessus, à une distance normale de lecture (25 à 35 cm).
Ne pas utiliser de loupe. Les images obtenues sont franches
et peuvent être reconnues facilement dans des conditions
normales d’éclairage. S’il y a des doutes sur la présence
d’agglutination, le test doit être répété en utilisant une
goutte de sérum physiologique de 40 µl. Il ne doit pas y avoir
d’agglutination visible. Cette image doit être utilisée comme
base pour la comparaison.
Etape 7Jeter les cercles de réaction utilisés selon les règles de sécurité
appropriées. Vérifier que les réactifs latex ont bien été remis
au réfrigérateur.
9. RESULTATS
LECTURE DES RESULTATS
Se référer au guide de lecture Wellcolex* Colour Shigella.
Positif
Un changement de couleur du produit dû à l’agglutination de l’une
des suspensions colorées de latex dans le mélange se produit au
cours de la réaction, induisant un changement de contraste dans
la couleur du fond (figures 1 et 2). Généralement, l’agglutination
est d’une seule couleur pour un réactif latex mais, avec une culture
mixte de Shigella, on peut néanmoins observer l’agglutination de 2
couleurs pour un réactif latex (dans ce cas, il faut entreprendre des
procédures d’isolement complémentaires) ou d’une seule couleur
pour les 2 réactifs. Ces divers cas de figure se distinguent sans
difficulté. En cas de réactions différentes de celles présentées
aux figures 1 et 2, vérifier et ajuster si nécessaire la vitesse de
l’agitateur.
Négatif
Aucun réactif latex ne s’agglutine et l’aspect violet homogène
demeure pratiquement inchangé tout au long du test (figure 3).
Noter cependant que de faibles traces de granularité peuvent
être détectées dans les images négatives, selon l’acuité visuelle
de l’opérateur.
Non spécifique
Toutes les particules s’agglutinent, donnant des amas violets sur
un fond éclairci (figure 4). Il est possible que quelques amas violets
apparaissent lors d’une réaction positive ou négative. Si ceci se
produit avec un net changement de couleur au cours du test ou
si le fond reste violet uniformément, il ne faut pas tenir compte
de ces agrégats violets.
10. CONTROLE QUALITE
Inspection visuelle
Toujours vérifier que les réactifs latex ne produisent pas
d’aggrégation lorsqu’ils sont distribués sur les cercles de réaction.
En cas d’agglutination avant l’ajout de l’échantillon de culture ou
de la suspension bactérienne, ne pas utiliser le réactif.
Procédures pour les contrôles
Les tests de contrôle qualité doivent être réalisés sur chaque kit
à la réception du numéro de lot de kit. Chaque laboratoire doit
appliquer les réglementations nationales et locales.
Procédure pour les contrôles positifs
Les contrôles positifs fournis permettent de valider la performance
des réactifs latex.
Etape 1Distribuer deux gouttes de réactif latex 1 et deux gouttes
de réactif latex 2 sur quatre cercles de réaction différents (1
goutte par cercle).
Etape 2 Ajouter une goutte de contrôle positif dans deux des cercles
de réaction (l’un contenant le réactif latex 1 et l’autre le réactif
latex 2).
Etape 3 Mélanger les réactifs à l’aide d’un bâtonnet d’échantillonnage
jetable différent pour chaque contrôle positif.
Etape 4Placer la carte sur un agitateur mécanique et agiter pendant
deux minutes à 150 ± 5 tr/mn. Ceci fait, l’agglutination doit
être visible sur les quatre cercles de réaction.
Etape 5Mettre les cartes de réaction au rebut selon la méthode
appropriée.
La couleur du latex agglutiné avec le réactif 1 et avec le réactif
2 doit correspondre à celle du contrôle positif (bleu ou rouge).
Des cultures d’espèces connues de Shigella en stock peuvent se
substituer au contrôle positif.
Procédure pour les contrôles négatifs
Recommencer la procédure de test en utilisant du sérum
physiologique à la place d’un échantillon de test. Aucune
agglutination significative ne doit être observée.
11. Interpretation des resultats
Un résultat positif (agglutination colorée) indique la présence
de Shigella et identifie les différentes espèces présentes dans
l’échantillon comme décrit dans le tableau suivant :
Couleur
Réactif
de
l’agglutination
du fond
1
2
Rouge
Bleu
Shigella
sonnei.
Shigella
dysenteriae
Bleu
Rose
Shigella
flexneri
Shigella
boydii
Aucune
Violet
Négatif
Violet
Clair
Non interprétable
(procédures d’isolement
complémentaires
nécessaires)
Les réactifs permettent de détecter Shigella sonnei (formes l et
ll), Shigella flexneri (sérotypes 1 à 6 et variants X et Y), Shigella
dysenteriae (sérotypes 1 à 12) et Shigella boydii (sérotypes 1 à 15).
Un résultat négatif indique que les germes testés ne font pas partie
des sérotypes de Shigella couverts par les réactifs. Si nécessaire,
ils peuvent être identifiés par des méthodes conventionnelles.3,4
Des croissances mixtes de germes ne fermentant pas le lactose
étant souvent présentes dans les coprocultures, il peut s’avérer
nécessaire, en cas de résultat négatif, de répéter le test sur une
autre sélection de colonies négatives pour le lactose avant de
considérer la culture comme négative.
En cas de réaction non spécifique, le résultat n’est pas
interprétable; il faut employer des méthodes d’identification
conventionnelles.3,4
12. LIMITES DE LA METHODE
12.1.Wellcolex* Colour Shigella identifie les isolats de Shigella
jusqu’au niveau de l’espèce. Si l’on désire procéder à
l’identification sérologique complète des types au sein des
espèces, il faut utiliser des méthodes conventionnelles ; la
sélection des antisérums appropriés peut être facilitée par
les résultats du test Wellcolex*.
12.2.Le genre Shigella est très proche d’autres membres de
la famille des entérobactéries et beaucoup d’antigènes
somatiques sont partagés avec des organismes provenant
d’autres espèces, en particulier Escherichia coli, mais aussi
Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides et d’autres espèces.
Ceux-ci représentent des antigènes communs et non pas
des réactions croisées ; on peut les différencier sur la base
de tests biochimiques. Beaucoup de ces espèces, mais pas
toutes, fermentent le lactose.
12.3.
Certaines souches de Shigella portent des antigènes
d’enveloppe inhibant l’agglutination « O » des suspensions.
Ceci ne s’est pas produit lors des essais des réactifs mais
l’enveloppe peut être inactivée, si nécessaire, en chauffant
la suspension à 100°C pendant 2 heures.2 Si un isolat bien
caractérisé sur le plan biochimique ne réagit toujours pas
avec les réactifs, il doit être envoyé à un laboratoire de
référence pour des études complémentaires.
12.4.La qualité de l’image d’agglutination obtenue dépend de la
vitesse et du diamètre orbital de l’agitateur rotatif ainsi que
de l’utilisation d’une carte de réaction bien plane.
13. RESULTATS ATTENDUS
Les souches appartenant aux sérotypes communs à S. sonnei,
S. flexneri, S. dysenteriae et S. boydii produisent une agglutination
rouge ou bleue avec le composant correspondant du réactif
latex 1 ou 2.
14. CARACTERISTIQUES SPECIFIQUES
Evaluation externe
Une étude effectuée dans plusieurs centres, faisant intervenir un
laboratoire de santé publique au Royaume-Uni, trois laboratoires
hospitaliers aux Etats-Unis, deux dans la péninsule Arabique
et trois en Asie du Sud-Est, a été réalisée pour évaluer le test
Wellcolex* Colour Shigella sur des cultures de routine pour
Shigella.
A partir de chaque échantillon fécal, chacun des laboratoires a
effectué des tests sur 1 ou plusieurs des échantillons suivants :
1.
Colonies négatives pour le lactose directement à partir
des géloses primaires sélectives (MacConkey, XLD, DCA,
SS et Hektoen).
2.
Colonies négatives pour le lactose directement à partir
des sous-cultures de bouillon d’enrichissement sur géloses
sélectives.
3.
Sous-cultures pures de colonies négatives pour le lactose
sur gélose nutritive.
L’agitateur rotatif a été utilisé pour l’intégralité du test. Les
résultats sont présentés dans le tableau 1.
La performance du test Wellcolex* Colour Shigella a été
déterminée par comparaison avec les résultats obtenus par des
analyses bactériologiques classiques des échantillons.
Dans cette étude, la sensibilité du test Wellcolex* Colour
Shigella était de 98,9% (88/89) à partir de cultures primaires sur
gélose, de 100% (58/58) à partir de sous-cultures de bouillon
d’enrichissement et de 100% (299/299) à partir de cultures pures
(voir le tableau 1).
La spécificité du test Wellcolex* Colour Shigella dans cette
étude était de 99,4% (521/524) à partir de cultures primaires sur
gélose, de 100% (320/320) à partir de sous-cultures de bouillon
d’enrichissement et de 95,2% (60/63) à partir de cultures pures.
La valeur prédictive d’un résultat positif à partir de cultures sur
gélose était de 98,7% (445/451) et celle d’un résultat négatif de
99,9% (901/902).
L’incidence de Shigella dans les échantillons étudiés était de
33,0% (446/1353).
La fréquence des réactions non spécifiques avec le test Wellcolex*
Colour Shigella était de 3,0% (19/632) pour les cultures primaires
sur gélose, de 2,1% (8/385) pour les sous-cultures de bouillon
d’enrichissement et de 1,8% (7/385) pour les cultures pures. Ces
échantillons ont été exclus du tableau 1.
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