BD FTM Mode d'emploi

MODE D'EMPLOI –
MILIEUX EN FLACONS
PRETS A L'EMPLOI
BA-257144,02
Rev.: August 2003
BD Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
APPLICATION
Le BD Fluid Thioglycollate Medium (milieu thioglycolate liquide) est un milieu d'enrichissement
liquide polyvalent utilisé dans des procédures qualitatives pour le test de stérilité, l’isolement et
la culture d’aérobies, d’anaérobies et de microaérophiles modérément exigeants. En
microbiologie clinique, il peut être utilisé comme milieu d'enrichissement des échantillons
cliniques.
PRINCIPES ET EXPLICATION DE LA METHODE
Méthode microbiologique.
Le Fluid Thioglycollate Medium a été élaboré par Brewer pour la culture rapide d'anaérobies et
d'aérobies.1 L'incorporation de la peptone de caséine fut effectuée par Vera en 1944.2
Ce milieu favorise la croissance d’un grand nombre de microorganismes, notamment
d’anaérobies stricts, sans aucune incubation, dans une atmosphère anaérobie. En plus de sa
faculté à diminuer le potentiel d'oxydoréduction, le thioglycolate de sodium a la capacité de
neutraliser l'activité antibactérienne des composés mercuriels. Ces caractéristiques rendent le
FTM très utile pour la mise en évidence de contamination dans des matériaux biologiques et
autres. En raison de sa propriété de promotion de croissance, cette formulation a été adoptée
par la pharmacopée américaine (USP), l'AOAC et la pharmacopée européenne (EP) comme
test de stérilité et milieu d'enrichissement.3-6 Le Fluid Thioglycollate Medium est largement
utilisé comme milieu d'enrichissement en microbiologie clinique, en particulier pour traiter des
échantillons provenant de sites anatomiques à stérilité primaire.7
Cependant, son faible potentiel d'oxydoréduction ne fait pas du BD Fluid Thioglycollate
Medium un milieu adapté pour les aérobies stricts tels que les non-fermentants, Micrococcus et
les microorganismes similaires. Pour ces microorganismes, il convient d'utiliser plutôt un Tryptic
Soy Broth ou un Brain Heart Infusion Broth.
Dans le BD Fluid Thioglycollate Medium, le glucose, la peptone et l'extrait de levure
fournissent les facteurs de croissance nécessaires à la croissance bactérienne. Le thioglycolate
de sodium et la L-cystine sont des agents réducteurs qui empêchent l'accumulation de
peroxydes, qui sont létales pour certains microorganismes. La résazurine est un indicateur
d'oxydoréduction, rose lorsqu'il est oxydé et incolore lorsqu'il est réduit. La quantité réduite de
gélose aide à maintenir un faible potentiel redox en stabilisant le milieu contre les courants de
convection, et en conservant ainsi l'anaérobiose dans les couches profondes du milieu.8 Les
composants gélosés du Fluid Thioglycollate Medium lui confèrent généralement un aspect
légèrement opaque.
Le milieu prêt à l'emploi décrit dans le présent document est rempli sous un jet d'azote gazeux,
ce qui entraîne une décoloration de l'indicateur résazurine. Toutefois, il est possible de l'utiliser
jusqu'à ce que 30 % environ du milieu (couche supérieure) soit oxydé, comme indiqué par une
coloration rose de la résazurine près de la surface. Si l'oxydation a dépassé ce stade, le bouillon
peut être réchauffé une fois à la vapeur ou au bain-marie, refroidi et utilisé.
L'USP autorise la présence d'eau dans le glucose (dextrose) et indique un dosage de 5,5 g pour
la formulation.3 La présence d'humidité n'étant pas souhaitée dans un milieu déshydraté, une
quantité équivalente de glucose est incorporée au milieu dans sa forme anhydre.
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REACTIFS
BD Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
Formule* par litre d'eau purifiée
Extrait de levure
5,0 g
Chlorure de sodium
Digestion pancréatique de caséine
15,0
Thioglycolate de sodium
Glucose (anhydre)
5,0
Résazurine
L-cystine
0,5
Gélose
pH 7,1 ± 0,2
*Ajustée et/ou complémentée en fonction des critères de performances imposés.
2,5 g
0,5
0,001
0,75
PRECAUTIONS
. A usage professionnel uniquement.
Ne pas utiliser de fioles présentant des signes de contamination microbienne, décoloration,
dessiccation ou fissure, ou d’autres signes de détérioration.
Consulter le document MODE D'EMPLOI GENERAL pour plus d'informations sur les
procédures de manipulation aseptique, les risques biologiques et l'élimination des produits
usagés.
STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION
Dès réception, conserver les fioles dans l’obscurité entre 2 et 8 °C jusqu’au moment de leur
utilisation. Ne pas les congeler ni les surchauffer. Les fioles peuvent être ensemencées jusqu'à
la date de péremption indiquée (voir l'étiquette du récipient ou de l'emballage), et incubées
pendant les durées recommandées.
Les fioles provenant de boîtes déjà entamées peuvent être utilisées jusqu’à la date de
péremption indiquée. Les fioles ouvertes doivent être utilisées immédiatement.
CONTROLE DE QUALITE PAR L'UTILISATEUR
Tester les échantillons avec les microorganismes indiqués dans le tableau ci-dessous. Pour
être conforme aux normes USP et EP, un inoculum de 10 à 100 UFC par récipient doit être
utilisé.3-5 La pharmacopée européenne prescrit d’incuber les récipients entre 30 et 35 °C pour
une durée maximale de 3 jours, à l'air ambiant. Pour obtenir une croissance optimale des
aérobies stricts, les fioles doivent être ventilées pendant l'incubation. Pour ce faire, il suffit de
desserrer légèrement les bouchons.
Souche de test
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Micrococcus luteus ATCC 9341
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Clostridium sporogenes ATCC 11437
Bacteroides vulgatus ATCC 8482
Sans ensemencement
* ++++ = opaque, dense
Croissance attendue (turbidité)*
+++ ou supérieure
++ ou supérieure
++ ou supérieure
+++ ou supérieure
+++ ou supérieure
+++ ou supérieure
+++ ou supérieure
Transparente à légèrement opalescente, couleur
ambre clair, la couche supérieure peut être rose
+++ = opalescent, dense
++ = opalescent
+ = voile léger
METHODE
Matériaux fournis
BD Fluid Thioglycollate Medium fourni en fioles (voir CONDITIONNEMENT pour plus
d’informations).
Matériaux non fournis
Milieux de culture auxiliaires, réactifs et matériel de laboratoire requis.
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Types d'échantillons
Le BD Fluid Thioglycollate Medium peut être utilisé comme milieu d'enrichissement pour tous
les types d'échantillons cliniques et non cliniques. En général, les cultures d'enrichissement
doivent uniquement être ensemencées si les échantillons sont dérivés de sites anatomiques à
stérilité primaire. Noter que certains anaérobies stricts nécessitent la présence d'hémine et de
vitamine K pour atteindre une croissance optimale. Si la présence de tels microorganismes est
attendue, le milieu peut être complémenté avec 10 mg d'hydrochlorure d'hémine et 1 mg de
vitamine K1 (ménadione) par litre.
Mode opératoire du test
Le BD Fluid Thioglycollate Medium peut généralement être utilisé sans prétraitement
supplémentaire. Si plus de 30 % du milieu a été oxydé avant son utilisation (révélé par la
coloration rose de l'indicateur résazurine), le milieu peut être réchauffé une fois pendant 5 min,
bouchons légèrement desserrés, à la vapeur ou dans de l'eau bouillante, puis refroidi et utilisé.
Le milieu étant rempli sous un jet de d'azote gazeux, la ventilation des récipients pendant
l'incubation favorise la croissance des bactéries strictement aérobies. La ventilation est assurée
en desserrant légèrement les bouchons.
Pour une préparation en microbiologie clinique, le milieu peut être complémenté avec 10 mg
d'hydrochlorure d'hémine par litre (préparer une solution mère diluée au 1/10 dans 0,1 N NaOH,
stériliser par filtration et ajouter la quantité appropriée dans la fiole) et 1 mg de vitamine K1 par
litre (préparer une solution mère diluée au 1/10 dans de l'éthanol absolu, stériliser par filtration et
ajouter la quantité appropriée dans la fiole). Les solutions mères d'hémine et de vitamine K
peuvent être réfrigérées pendant 4 semaines dans l'obscurité. Dans la mesure où une quantité
suffisante de sang ou de sérum provenant de l'échantillon est introduite dans la fiole pendant
l'ensemencement, l'incorporation d'un complément est inutile. Ensemencer les échantillons
directement dans le milieu et incuber les tubes pendant un maximum de 7 jours à 35 ± 2 °C.
Noter que les échantillons doivent aussi être ensemencés directement dans des milieux solides,
tels qu'une BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood ou une BD Trypticase Soy Agar II with
5% Sheep Blood et, le cas échéant, dans d'autres milieux sélectifs et non sélectifs. Il convient
d'utiliser une BD Schaedler Agar with Vitamin K1 and 5% Sheep Blood pour l'isolement et la
culture d'anaérobies stricts. Le BD Fluid Thioglycollate Medium ne produisant pas de résultats
optimaux en ce qui concerne l'enrichissement de certains aérobies stricts, un deuxième milieu
d'enrichissement liquide , comme un Brain Heart Infusion Broth, peut être ensemencé avec
l'échantillon.
Pour le test de stérilité, respecter les recommandations des pharmacopées américaine et
européenne et celles émises par certains organismes de contrôle.3-6 Ces références spécifient le
ratio milieu/produit qu'il convient d'appliquer pour les tests de stérilité, et fournissent des détails
relatifs à l'échantillonnage et à l'interprétation des résultats de test. Si l'échantillon testé rend le
milieu turbide à un point tel qu'il devient difficile d'y observer la croissance microbienne, il
convient d'effectuer un transfert vers un nouveau milieu.
Résultats
A l’issue de l’incubation, la croissance bactérienne est mise en évidence par la présence d'une
certaine turbidité à l'intérieur des tubes. En cas de doute, repiquer des échantillons appropriés
sur des milieux d'étalement. Cette procédure est également recommandée lorsque les
microorganismes isolés doivent subir des procédures d'identification supplémentaires. Les
microorganismes anaérobies ayant été soumis à une ventilation avant ou pendant la période
d'incubation, se développent uniquement dans la couche de bouillon située en-dessous de la
couche supérieure oxydée (rose).
Pour isoler des pathogènes à partir d'échantillons cliniques, repiquer 10 à 50 µL de milieu
incubé sur une BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood ou une BD Trypticase Soy Agar II
with 5% Sheep Blood pour les aérobies et sur une BD Schaedler Agar with Vitamin K1 and
5% Sheep Blood ou une BD CDC Anaerobe Agar with 5% sheep blood pour les anaérobies
stricts. Noter qu'il faut impérativement observer les conditions atmosphériques qui conviennent
lors des repiquages.
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CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ET LIMITES DE LA PROCEDURE
Le BD Fluid Thioglycollate Medium est utilisé comme milieu d'enrichissement dans de
nombreuses applications cliniques ou non cliniques.3-5,7,8 Grâce à ses puissantes propriétés
réductrices, il fournit des conditions adaptées à l'anaérobiose sans qu'une incubation en
atmosphère anaérobie soit nécessaire. Pour une mise en évidence optimale des anaérobies
exigeants, tels que Prevotella spp., le milieu doit être complémenté avec de l'hémine et de la
vitamine K1 (voir Mode opératoire du test).
Bien que la plupart des aérobies obligatoires (p. ex. Micrococcus, Pseudomonas et genres
associés, et les bâtonnets sporulés strictement aérobies) se développent lorsque les fioles sont
ventilées pendant l'incubation (en général la croissance se présente comme une fine pellicule,
près de la surface), le Fluid Thioglycollate Medium n'est pas le milieu le mieux adapté à la mise
en évidence des aérobies stricts. Pour cela, il convient d'utiliser plutôt un Tryptic Soy Broth ou
un Brain Heart Infusion Broth.
Après avoir été réchauffé une fois, le FTM ne doit plus être chauffé à nouveau car cela réduirait
la performance microbiologique du milieu.
La croissance obtenue dans ce milieu doit être repiquée dans des milieux solides appropriés,
afin de produire des cultures pures qui pourront ensuite être identifiées selon les méthodes
adaptées à ce(s) isolat(s).
REFERENCES
1. Brewer, J.H. 1940. Clear liquid medium for the "aerobic" cultivation of anaerobes. J. Am. Med. Assoc.
115:598-600.
2. Vera, H.D. 1944. A comparative study of materials suitable for the cultivation of clostridia. J. Bacteriol.
47:59-70.
3. U.S. Pharmacopeial Convention, Inc. 1999. The U.S. Pharmacopeia 24/The national formulary 19-2000. U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md
4. Council of Europe, 1996. European Pharmacopoeia, 3rd edition. European Pharmacopoeia
Secretariat. Strasbourg/France.
5. Council of Europe, 2000. European Pharmacopoeia, Supplement 2001. European Pharmacopoeia
Secretariat. Strasbourg/France.
6. Cunniff, P. (ed.). 1995. Official methods of analysis of AOAC International, 16th ed. AOAC
International, Gaithersburg, Md.
7. Thomson, R.B., and J.M. Miller. 2003. Specimen collection, transport, and processing: bacteriology.
In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of
clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
8. MacFaddin, J.F. 1985. Media for isolation-cultivation- identification-maintenance of medical bacteria,
vol. I. Williams & Wilkins, Baltimore.
CONDITIONNEMENT
BD Fluid Thioglycollate Medium: Milieu en flacons prêt à l’emploi
No réf. 257144
50 unités par carton ; 20 mL, en fiole de 30 mL à bouchon à vis
INFORMATIONS COMPLEMENTAIRES
Pour plus d’informations, contacter le représentant local de BD.
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