Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Bovine BVDV Ab Plate Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit
Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques du Virus de la Diarrhée Virale Bovine dans le sérum,
le plasma et le lait de bovins (lait de tank)
Référence Catalogue 7588940
Pub. Nº MAN0013808 Rév. C.0
AVERTISSEMENT! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des
gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit
disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Introduction
Le virus de la diarrhée virale bovine (BVD) est un Pestivirus de la famille des Flaviviridae qui est présent dans le monde entier. Il provoque des avortements chez les vaches en gestation, ce qui entraîne des pertes économiques importantes pour les producteurs de lait. Les vaches gestantes infectées par la
BVD transmettent l'infection au fœtus par passage transplacentaire du virus, et peuvent donner naissance à des veaux infectés permanents immunotolérants (ou IPI). Ces derniers sont une source continue de propagation du virus dans l'environnement, et ils contaminent ainsi les autres animaux du
troupeau. Par ailleurs leur sérologie BVD est négative ou faiblement positive.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit détecte les anticorps spécifiques de différentes souches du virus de la BVD (Ia, Ib et II) dans
le sérum, le plasma et le lait (de tank). Il peut être utilisé pour diagnostiquer l'infection à BVD chez les animaux, individuellement ou à l'échelle du
troupeau. La surveillance de l’infection à BVD est réalisée en prélevant 2 échantillons de sérum ou de plasma sur l'animal (à 4 semaines au moins
d'intervalle) et en titrant les anticorps spécifiques. PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit est également un outil précieux pour le dépistage à grande
échelle et les programmes d'éradication. Il peut servir par ailleurs (bien que cette utilisation ne soit pas entièrement validée) à identifier les anticorps
spécifiques des Pestivirus dans le sérum de moutons et de porcs.
Principe du test
PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit utilise deux anticorps monoclonaux, l'un coaté dans les puits d'une microplaque, l'autre servant de conjugué. Les
deux anticorps monoclonaux reconnaissent des épitopes différents de la protéine non structurale NS-3 du virus de la BVD (P80) qui est une protéine
hautement conservée. Les prélèvements de sérum ou de plasma non dilués et les échantillons de lait sont d'abord incubés avec l'antigène inactivé du virus
de la BVD dans la microplaque qui est ensuite lavée. Puis le conjugué est distribué dans les puits. Après incubation et lavage de la plaque, le substrat
chromogène est ajouté et la plaque est à nouveau incubée. Le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm
afin de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifiques de la BVD.
Composition du coffret
Coffret de 5 plaques pour 440 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à
la date d’expiration qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de
conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou
reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (ci-dessous).
Composant
Description
1 : Microplaque
Cinq microplaques.
2 : Conjugué (30x)
Concentré 30x, à diluer avant utilisation.
Un flacon contenant 2.5 mL de conjugué.
3 : Tampon de dilution (5x)
Concentré 5x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 60 mL de tampon de dilution. Conservation
du tampon de dilution 1x : 4 heures à 22±3°C.
4 : Antigène
Lyophilisé. Cinq flacons contenant 6.0 mL d'antigène
lyophilisé. Conservation de l’antigène reconstitué :
jusqu’à la date de péremption à −20°C.
5 : Sérum de cheval
Lyophilisé. Un flacon contenant 3.5 mL de sérum de
cheval. Conservation du sérum de cheval
reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C.
6 : Eau déminéralisée
Un flacon contenant 10 mL d'eau déminéralisée.
7 : Solution de lavage (200x)
Concentré 200x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 60 mL de solution de lavage. Conservation
de la solution de lavage 1x : 1 semaine à 22±3°C.
8 : Sérum de contrôle 1
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de sérum
de contrôle 1.
9 : Sérum de contrôle 2
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de sérum
de contrôle 2.
10 : Sérum de contrôle 3
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de sérum
de contrôle 3.
11 : Lait de référence 1
Prêt à l’emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de lait de
référence 1.
12 : Lait de référence 2
Prêt à l’emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de lait de
référence 2.
13 : Substrat chromogène
(TMB)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de
substrat chromogène (TMB).
14 : Solution d'arrêt
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de
solution d'arrêt.
Autres composants du coffret
• Notice d'utilisation
• 10 films adhésifs pour couvrir les plaques
Equipement nécessaire mais non fourni
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com.
Use
Général
Description
Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Analyse des
résultats
Lecteur de microplaques : Multiskan EX ou équivalent. Le lecteur doit
être équipé d'un filtre permettant de lire les plaques à 450 nm.
Optionnel
Laveur de microplaques.
Mode opératoire
Précautions
• Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte.
• PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit ne doit être réalisé que dans
les laboratoires équipés pour cela.
• Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement
infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être
considéré comme potentiellement contaminé.
Remarques
Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab
Plate Kit, les précautions suivantes doivent être prises :
• Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi.
• Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C)
avant utilisation.
• L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel
échantillon ou réactif est prélevé.
• Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif.
• Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de
péremption ou si un changement dans leur aspect est observé.
• Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots
différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests.
Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une
eau équivalente. Solutions à préparer à l'avance
Tampon de dilution 1x
Le tampon de dilution (5x) (Composant 3) doit être dilué au 1:5 avec de l'eau
déminéralisée (1 volume de tampon de dilution + 4 volumes d'eau déminéralisée). Le tampon de dilution 1x peut être conservé 4 heures à 22±3°C.
Antigène
Amener le flacon à 22±3°C et reconstituer l'antigène (Composant 4) avec 6.0 mL
le volume indiqué de tampon de dilution 1x. L'antigène reconstitué peut être
conservé en aliquot de 1.0 mL à −20°C jusqu’à la date de péremption.
Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :
1. Ramener le flacon à T° ambiante (22±3°C).
2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour
s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.
3. Ouvrir le flacon.
4. Ajouter la quantité indiquée d'eau déminéralisée ou de tampon de
dilution (voir l'étiquette du flacon).
5. Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat.se dissoudre.
6. Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat.
7. Laisser le flacon reposer au moins 15 minutes à 22±3°C avant utilisation.
8. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la
formation de mousse).
Sérum de cheval
Amener le flacon à 22±3°C et reconstituer le sérum de cheval (Composant 5)
avec 3.5 mL le volume indiqué d'eau déminéralisée. Le sérum de cheval
reconstitué peut être conservé à −20°C.
Tampon du conjugué
Ajouter 1 volume de sérum de cheval reconstitué à 19 volumes de tampon
de dilution. Par exemple, pour une plaque, préparer 12 mL (ajouter 0.6 mL
de sérum de cheval reconstitué à 11.4 mL de tampon de dilution 1x). Le
tampon du conjugué peut être conserve 4 heures à 22±3°C.
Dilution du conjugué
Diluer le conjugué (30x) (Composant 2) au 1:30 dans du tampon de conjugué;
par exemple pour une plaque, préparer 12 mL (ajouter 400 µL de conjugué
(30x) à 11.6 mL de tampon de conjugué).
Note : Le conjugué dilué doit être préparé juste avant l’utilisation.
Solution de lavage
Diluer la solution de lavage (Composant 7) au 1:200 dans de l'eau déminéralisée.
La quantité fournie de solution de lavage permet de préparer un volume final
de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage 1x : 1 semaine à 22±3°C.
Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique
ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques
peut être fait manuellement avec 200 µL de solution de lavage par puits.
Puis vider les plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est
pas utile d'égoutter les plaques sur du papier absorbant entre les lavages.
Les tapoter fermement après le dernier cycle de lavage.
Remarque : Voir Annexe B pour la préparation et la conservation des
échantillons.
Incubation des échantillons, de l'antigène et du conjugue
1. Distribuer 100 µL de tampon de dilution 1x dans les puits A1 et B1
(= DO450 blanc).
2. Ajouter 50 µL de l’échantillon de référence approprié dans les puits
indiqués dans le tableau suivant.
Réactif
Puits
Type d’échantillon : sérum ou plasma
Sérum de référence 1 (composant 8)
C1 et D1 (=DO450 max)
Sérum de référence 2 (composant 9)
E1 et F1
Sérum de référence 3 (composant 10)
G1 et H1
Type d’échantillon : lait (individuel ou tank)
Lait de référence 1 (composant 11)
C1 et D1 (=DO450 max)
Lait de référence 2 (composant 12)
E1 et F1
3. Déposer 50 µL de chaque échantillon dans les autres puits.
4. Distribuer 50 µL d'antigène BVD reconstitué dans tous les puits sauf
dans les puits A1 et B1.
5. Couvrir la plaque (Composant 1) avec un film adhésif et les agiter
doucement.
6. Incuber la plaque 60±5 minutes à 22±3°C.
7. Vider la plaque et la laver 6 fois avec la solution de lavage dilué. La
tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de
lavage.
8. Distribuer 100 µL de la dilution du conjugué fraîchement préparée dans
tous les puits.
9. Couvrir la plaque avec un film adhésif et les incuber 1 heure à
60±5 minutes à 22±3°C.
Incubation avec le substrat chromogene (TMB)
1. Vider la plaque et la laver 6 fois avec la solution de lavage dilué. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage.
2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 13) dans
tous les puits.
3. Incuber les plaques 15 minutes à 22±3°C.
4. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 14) dans tous les puits.
5. Homogénéiser le contenu des puits.
Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir
déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits.
Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre
et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB).
Lecture du test et calcul des résultats
1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes
suivant l'addition de la solution d'arrêt.
2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (= DO450 blanc).
3. Calculer la DO450 corrigée de tous les échantillons en soustrayant la
DO450 blanc.
4. Calculer la DO450 moyenne des puits C1 and D1 (= DO450 max).
5. Calculer le pourcentage d’inhibition (PI) des échantillons de référence
et des échantillons à tester dans les puits E1 à H12 en utilisant la
formule suivante.
La DO450 de chaque échantillon est exprimée en pourcentage d'inhibition
(PI) par rapport à la DO450 max :
PI = 100 − (DO450 de l'échantillon corrigée / DO450 max corrigée) × 100
2
Interprétation des résultats
Validation des critères
1. La DO450 blanc moyenne (puits A1 et B1) doit être <0.150.
2. La moyenne corrigée de la DO450 max (puits C1 et D1) doit être ≥ 1,000
pour le sérum de référence 1 ou ≥ 0,800 pour le lait de référence 1.
3. Le PI du sérum de contrôle 2 doit être >50.
4. Le PI du sérum de contrôle 3 doit être <50.
5. Le pourcentage d’inhibition du lait de référence 2 doit être >30.
Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont
ininterprétables.
Remarque : Si la DO450 max est inférieure à 1.000, la solution de substrat
chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de son utilisation.
Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C avant
utilisation ou incuber plus longtemps les barrettes (sans dépasser
30 minutes d'incubation).
Interprétation du pourcentage d'inhibition
Echantillons de sérum et de plasma
PI = <50% Négatif Absence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement.
PI = ≥50% Positif Présence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement.
Pour le titrage des anticorps dans le sérum ou le plasma, le titre des anticorps
est défini comme l'inverse de la plus grande dilution donnant un PI ≥50%.
Le diagnostic d'infection transitoire à BVD est posé lorsque, sur deux
échantillons prélevés à la phase aiguë et à plus de quatre semaines
d'intervalle, le titre des anticorps passe d'indétectable à détectable ou si le
titre des anticorps est multiplié par quatre entre les 2 prélèvements.
Echantillons de lait
PI = <30% Négatif Absence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement.
PI = ≥30% Positif Présence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement.
Disposition recommandée de la microplaque
La disposition suivante permet un ajout efficace des échantillons et témoins
pré-dilués dans la microplaque (B : solution de tampon de dilution préparée
préalablement ; R1 : Référence 1 ; R2 : Référence 2 ; R3 : Référence 3 [facultatif] ;
E : Échantillon).
Tableau 1 Dispositions de plaque : Microplaque
1
2
3
4
5
6
7
A
B
E
E
E
E
E
E
B
B
E
E
E
E
E
E
C
R1
E
E
E
E
E
E
D
R1
E
E
E
E
E
E
E
R2
E
E
E
E
E
E
F
R2
E
E
E
E
E
E
G R3 ou S E
E
E
E
E
E
H R3 ou S E
E
E
E
E
E
8
E
E
E
E
E
E
E
E
9
E
E
E
E
E
E
E
E
10
E
E
E
E
E
E
E
E
11
E
E
E
E
E
E
E
E
12
E
E
E
E
E
E
E
E
Annexe A – Références bibliographiques
1. Deregt D and Loewen KG (1995). Can Vet J 36:371−378.
2. Kramps JA, Van Maanen C, Van de Wetering G, Stienstra G, Quak S,
Brinkhof J, Ronsholt L, Nylin B (1999). Vet Microbiol Jan. 64(2-3):135−144.
3. Paton DJ, Ibata G, Edwards S, Wensvoort G (1991). J Vir Meth
31:315−324.
Annexe B – Préparation et conservation des échantillons
Lait
Sérum et plasma
• Avant d'être testés, les
échantillons de lait doivent
être dégraissés par
centrifugation 15 min. à
1000 × g. Utiliser une pipette
pour prélever l'échantillon
sous la couche de crème du
lait. Plutôt que de centrifuger
les échantillons de lait, on
peut également les garder
16 heures au réfrigérateur.
• Les échantillons de lait
dégraissés peuvent être
conservés à −20°C avant
d'être testés.
• Les échantillons de sérum et de plasma
peuvent être conservés à −20°C avant d'être
testés.
• Les échantillons de sérum et de plasma
peuvent être titrés avec PrioCHECK™ Bovine
BVDV Ab Plate Kit. Préparer pour cela des
dilutions de 2 en 2 (1:10 à 1:1280) en tampon
de dilution.
• Les échantillons de sérum ou de plasma
fraîchement collectés peuvent,
occasionnellement, donner des résultats
faiblement positifs (faux positifs). Ce
phénomène peut être évité en congelant et
décongelant une fois les prélèvements ou
par inactivation 30 minutes à 56°C.
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières
nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches
Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits
chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit Notice d’Utilisation
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits
selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous
avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands
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CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES
ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES
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DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. N° MAN0013808 (français)
Rév.
Date
Description
C.0
B.0
1er novembre 2022
• Les critères de validation du sérum de référence 1 et du lait de
référence 1 ont été mis à jour.
11 mars 2022
• Le lait de référence 1 et le lait de référence 2 ont été ajoutés au
document (voir Composants du kit, Procédure de test et
Interprétation des résultats).
• La disposition recommandée de la microplaque a été ajoutée au
document.
• Nouveau document. Conversion effectuée du document existant
(PrioCHECK BVDV Ab 7588940 v1.0_f.doc) sur le modèle du
document en cours, avec mises à jour associées aux informations
A.0
24 juillet 2019
de licence limitée, à la garantie, aux marques et aux logos.
• Changement du nom du kit de PrioCHECK® BVDV Ab en
PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit.
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1er novembre 2022
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