Macherey-Nagel NucleoMag RNA Blood Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
ARN à partir de sang
n NucleoMag® RNA Blood
Avril 2024 / Rev. 02
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ARN à partir de sang
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur
4
1.3 Tampons, consommables et équipements supplémentaires à fournir pour la
procédure de traitement des Tempus™ Blood RNA Tubes
6
1.4 Tampons supplémentaires à fournir pour la procédure de traitement des tubes
collecteurs de sang EDTA / ​citrate
6
1.5 A propos de ce manuel
6
2 Description du produit
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques du kit
7
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
8
2.4 Systèmes de séparation magnétique
8
2.5 Réglage des paramètres d’agitation
9
2.6 Manipulation des billes
11
2.7 Procédures d’élution
12
2.8 Assistance à l’automatisation
12
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
13
4 Instructions de sécurité
14
4.1 Elimination des déchets
14
®
5 Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans des tubes collecteurs S-Monovette
RNA Exact de SARSTEDT ou DNA/RNA Shield™Blood de Zymo Research.
15
6 Extraction d’ARN à partir de sang collecté dans des tubes Tempus™ Blood RNA
21
7 Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans des tubes collecteurs
EDTA / ​Citrate
29
8 Annexes
35
8.1 Guide de résolution des problèmes
35
8.2 Informations de commande
37
8.3 Restrictions d’utilisation du produit / ​garantie
38
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
3
ARN à partir de sang
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® RNA Blood
1 × 96 preps
744352.1
4 × 96 preps
744352.4
NucleoMag® B-Beads
1.8 mL
4 × 1.8 mL
Tampon de fixation MRB1
50 mL
200 mL
Tampon de lavage MRB2
125 mL
1 × 300 mL
REF
1 × 125 mL
H2O RNase-free
30 mL
60 mL
Protéinase K liquide
1.8 mL
7 mL
rDNase, lyophilisée*
3 flacons (taille D) 12 flacons (taille D)
Tampon de réaction pour la rDNase
Notice d’utilisation
1.2
60 mL
3 × 60 mL
1
1
Réactifs, équipements et consommables à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
Éthanol à 80 % (v/v) pour les étapes de lavage (éthanol absolu ou non dénaturé)
Échantillons
•
Echantillons de sang, collectés dans des tubes collecteurs de sang EDTA / ​citrate ou
dans l’un des tubes collecteurs de sang suivants (les tubes collecteurs de sang ne
sont pas fournis avec le kit NucleoMag® RNA Blood) :
Tube collecteur de sang
®
Fournisseur
S-Monovette RNA Exact
SARSTEDT (01.2048.001)
Tempus™ Blood RNA Tubes
Applied Biosystems by Thermo Fisher
Scientific (4342792)
DNA/RNA Shield™ Blood Tubes
Zymo Research (R1150)
4
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
Consommables
•
Cônes de pipette stériles RNase-free (recommandé)
Produit
REF
Conditionnement
Système de séparation magnétique
p.e., NucleoMag® SEP (voir le paragraphe 2.3) ; il
est également possible d’utiliser des dispositifs de
manipulation des liquides ou des extracteurs à
barreaux magnétique automatisés tels que
IsoPure™ Mini, MagnetaPure 32 Plus ou
KingFisher® Flex*.
744900
1
Plaques pour la séparation des billes
740481
4
magnétiques,
740481.24 24
p.e., Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits
carrés de 2.1 mL)
Consommables pour l’automate KingFisher®
Flex :
ex. Kit d’accessoires ’96-well Accessory Kit B’
pour KingFisher™ (Square-well Blocks, tip combs,
plaques d’élution pour 4 × 96 preps NucleoMag®
RNA Blood).
744951
1 set
Plaques 96 puits profonds pour les systèmes à
barreaux magnétiques
p.e. pour MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini
744955
25
Tips comb 8 positions pour les systèmes à
barreaux magnétiques p.e. pour MagnetaPure 32
Plus ou IsoPure™ Mini
744960
50
*Veuillez contacter MACHEREY‑NAGEL pour une assistance technique.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
5
ARN à partir de sang
1.3
Tampons, consommables et équipements
supplémentaires à fournir pour la procédure de traitement
des Tempus™ Blood RNA Tubes
•
Tampon de lyse DL (REF 740202.32 ; flacon de 100 mL ; voir les informations de
commande)
•
H2O RNase-free (REF 740378.1000 flacon de 1000 mL ; voir les informations de
commande)
•
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
•
Tubes coniques de 50 mL avec bouchon à vis
•
Vortex, p.e. Vortex-Genie®2 (Scientific Industries)
•
Centrifugeuse avec rotor à godet pivotant et adaptateurs pour tubes coniques de
50 mL (capacité de 4 °C, 3000 à 4400 × g)
1.4
Tampons supplémentaires à fournir pour la procédure de
traitement des tubes collecteurs de sang EDTA / ​citrate
•
Tampon de lyse DL (REF 740202.32 ; flacon de 100 mL ; voir les informations de
commande)
•
Tampon de lavage RAW (REF 740361.150 ; flacon de 150 mL ; voir les informations
de commande)
1.5
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire les paragraphes détaillés
du protocole du kit NucleoMag® RNA Bood avant d’utiliser ce produit. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du
protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil de suivi rapide de la
procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn‑net.com
6
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
2
Description du produit
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® RNA Blood permet d’extraire l’ARN à partir d’échantillons de sang.
Les tubes collecteurs de sang avec stabilisation des ARN de SARSTEDT, Zymo Research
et Thermo Fisher Scientific ainsi que les tubes collecteurs de sang EDTA/citrate peuvent
être traités. La procédure NucleoMag® RNA Blood est basée sur l’adsorption réversible
d’acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampons
appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par une digestion à la protéinase
K. Pour ajuster les conditions dans lesquelles les acides nucléiques se lient aux billes
paramagnétiques, le tampon MRB1 et les NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat.
Après la séparation magnétique et deux étapes de lavage, les billes paramagnétiques
sont incubées avec une DNase recombinante pour éliminer l’ADN copurifié. Après une
étape de refixation de l’ARN, les contaminants résiduels et les sels sont éliminés par une
étape de lavage supplémentaire. L’éthanol résiduel de l’étape de lavage précédente est
éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ARN hautement pur est élué avec de l’H2O RNase-free
et l’ARN peut être directement utilisé pour des applications en aval. Le kit peut être utilisé
manuellement ou automatiquement sur des robots pipeteurs standard ou des séparateurs
magnétiques automatisés.
Les tubes collecteurs de sang S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT et DNA/RNA
Shield™ Blood de Zymo Research peuvent être traités avec le même protocole. Les
tubes de prélèvement de sang dans EDTA/citrate et de Tempus™ Blood RNA de
Thermo Fisher Scientific nécessitent une procédure avec un protocole adapté (voir
paragraphe 5 ou paragraphe 6).
2.2
Caractéristiques du kit
•
Le kit NucleoMag® RNA Blood est conçu pour la préparation rapide, manuelle et
automatisée à petite échelle d’ARN très pur à partir d’échantillons de sang stabilisés
ou EDTA/citrate. Le kit est conçu pour être utilisé avec le séparateur magnétique
NucleoMag® SEP (voir les informations de commande, paragraphe 8.2) ou d’autres
systèmes de séparation magnétique (voir paragraphe 2.4). En règle générale, 96
échantillons peuvent être purifiés en 120 minutes lorsque la purification est effectuée
manuellement à l’aide du NucleoMag® SEP, ou en 90 minutes environ avec les
systèmes de barreaux magnétiques automatisés, selon le type et la configuration du
système.
•
L’ARN purifié peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR ou tout
type de réaction enzymatique.
•
Grâce à la DNase recombinante fournie avec le kit, l’ARN élué est pratiquement
exempt d’ADN.
•
Réserver à l’usage de la recherche.
•
NucleoMag® RNA Blood permet une automatisation facile sur les instruments
courants de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques
automatisés, par exemple les instruments MagnetaPure 32 Plus et IsoPure™ de
MACHEREY‑NAGEL ou les instruments KingFisher® deThermo Fisher Scientific. Le
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
7
ARN à partir de sang
temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système
de séparation magnétique utilisé.
•
Le kit fournit des réactifs pour la purification d’un maximum de 6 μg d’ARN pur à
partir d’échantillons appropriés. Les rendements typiques se situent entre 3 µg et
4 µg d’ARN. Selon le volume d’élution utilisé, des concentrations de 40 à 80 ng/μL
peuvent être obtenues.
•
Le NucleoMag® RNA Blood peut être entièrement traité à température ambiante.
•
Les NucleoMag® B-Beads sont des billes superparamagnétiques hautement
réactives. La capacité de fixation est d’environ 0,4 μg / ​μL d’ARN pour 1 μL de
suspension de NucleoMag® B-Beads.
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
Environnement de travail
Maintenir un environnement de travail exempt de RNase A. Porter des gants à tout
moment pendant la préparation. Changer fréquemment de gants.
Stockage des échantillons
Le protocole est optimisé pour l’extraction de l’ARN à partir des tubes collecteurs de
sang S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT, des DNA/RNA Shield™ Blood de Zymo
Research. Les tubes Tempus™ Blood RNA de chez Thermo Fisher Scientific nécessite
cependant une adaptation du protocole.
Manipuler et conserver les tubes collecteurs de sang conformément aux instructions
du fabricant. Inverser les tubes collecteurs de sang plusieurs fois avant de prélever une
aliquote pour l’extraction. Décongeler les tubes de prélèvement sanguin congelés de
SARSTEDT, Zymo Research ou Thermo Fisher Scientific immédiatement avant l’extraction
de l’ARN et les laisser s’équilibrer à température ambiante avant de prélever une aliquote
pour l’extraction. La congélation des tubes collecteurs de sang EDTA ou citrate présente
le risque de dégradation de l’ARN au cours de la procédure de décongélation.
Il est fortement recommandé de procéder à la procédure des échantillons de sang EDTA / ​
citrate dans les quelques heures qui suivent leur collecte. Les échantillons doivent être
conservés à 4 °C pendant 24 heures au maximum. Les ARNm contenus dans les cellules
sanguines ont des stabilités différentes. Par conséquent, afin de s’assurer que l’ARN isolé
contient une distribution représentative des ARNm, les échantillons de sang ne doivent
pas être stockés pendant de longues périodes avant d’isoler l’ARN.
Porter des gants en permanence pendant la préparation. Changer fréquemment de gants.
2.4
Systèmes de séparation magnétique
Pour l’utilisation du NucleoMag® RNA Blood, il est recommandé d’utiliser le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Blocks
(voir les informations de commande, paragraphe 8.2). Le kit peut également être utilisé
avec d’autres séparateurs courants. Voir les informations de commande des fournisseurs
pour les plaques de séparation appropriées.
8
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
Séparateur magnétique
®
Plaque ou tube de séparation
NucleoMag SEP (MN REF 744900)
Square-well Block (MN REF 740481/.24)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans couvercle
(Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs à aimants statiques, par exemple, NucleoMag® SEP (pour une utilisation
manuelle et sur les stations de travail de manipulation des liquides) : Ce type de séparateur
sont recommandés en combinaison avec un agitateur de microplaques approprié pour
une remise en suspension optimale des billes pendant les étapes de lavage et d’élution.
Alternativement, les billes peuvent être remises en suspension dans le tampon par
pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement automatisée sur les stations de
travail de manipulation des liquides, un bras manipulateur est nécessaire. La plaque est
transférée vers le séparateur magnétique pour la séparation des billes et transférée vers le
module agitateur pour la remise en suspension des billes.
Systèmes magnétiques mobiles
Pour les séparateurs à aimants mobiles, les aimants / ​tiges magnétiques sont déplacés
d’un côté à l’autre du puits et vice versa. Les billes suivent ce mouvement et sont ainsi
entraînées à travers le tampon pendant les étapes de lavage et d’élution. La séparation a
lieu lorsque le système s’arrête.
Séparateurs automatisés
Pour ce type de séparateurs à aimants mobiles, les billes magnétiques sont transférées
dans des plaques ou des tubes appropriés. Les billes sont remises en suspension à
partir des aimants recouverts de protection. Après chaque étape de fixation, de lavage
ou d’élution, les billes sont collectées et transférées automatiquement dans le réactif
correspondant à l’étape suivante.
2.5
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution,
les paramètres d’agitation doivent être soigneusement réglés pour chaque plaque de
séparation et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits à
l’autre. Procéder comme suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de lavage :
•
Charger 900 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer
la plaque sur l’agitateur et commencer à agiter avec un paramètre de vitesse
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
9
ARN à partir de sang
modérée pendant 30 secondes. Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites
gouttelettes d’eau colorée à la surface de la plaque.
•
Augmenter le paramètre de vitesse, agiter pendant 30 secondes supplémentaires et
vérifier à nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
•
Continuer à augmenter le paramètre de vitesse jusqu’à ce que vous observiez des
gouttelettes sur le dessus de la plaque de séparation. Réduire le paramètre de
vitesse, vérifier à nouveau et utiliser ce réglage pour l’étape de lavage.
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution :
•
Charger 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de collecte et procéder
comme décrit ci-dessus.
10
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
2.6
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque
de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par
conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement
remises en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur
un vortex. Mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation
permet une distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque
de séparation. Lors de l’automatisation, il est recommandé de procéder à une étape
de prémélange avant d’aspirer le mélange billes / ​tampon de fixation du réservoir afin de
maintenir les billes remises en suspension.
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des
aimants, de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation
et les aimants et du volume à traiter. Les temps d’aimantation des billes doivent être
vérifiés et ajustés pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes
de séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique.
Lavage des billes
Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement au
mélange par pipetages successifs, le mélange par agitation permet de mélanger
simultanément tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre de
cônes nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est
cependant plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique.
Efficacité de
la remise en
suspension
Vitesse
Nombre de cônes
nécessaires
Mélange
magnétique
+
++
Faible
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Haut
Méthode
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, *pipette 8-canaux
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
11
ARN à partir de sang
2.7
Procédures d’élution
L’ARN purifié peut être élué directement avec le H2O RNase-free fourni. L’élution peut
être effectuée dans un volume de ≥ 50 μL jusqu’à 100 µL. Il est essentiel de recouvrir
complètement les NucleoMag® B-Beads avec du H2O RNase-free pendant l’étape
d’élution. Le volume de RNase-free H2O utilisé dépend du système de séparation
magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur de la plaque de séparation). Pour une
élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis en suspension
dans l’H2O RNase-free.
2.8
Assistance à l’automatisation
Les kits d’extraction MN sont conçus pour une automatisation rationalisée, offrant une
compatibilité avec une gamme de systèmes robotiques ouverts. Que vous utilisiez des
systèmes à barreaux magnétiques ou des manipulateurs de liquides comme Hamilton,
Tecan, Eppendorf ou d’autres plateformes, nos kits garantissent des procédures
d’extraction efficaces et fiables. Contactez-nous pour obtenir une assistance complète et
des solutions d’automatisation sur mesure, afin de rendre votre expérience d’extraction
se déroule sans problème.
Des questions pour l’assistance à la programme ou au service d’automatisation de
MACHEREY‑NAGEL ?
Veuillez nous contacter pour une assistance personnalisée :
Téléphone : +49 2421 969 333
Courriel : support@mn-net.com
Pour plus d’informations, visitez notre site web : www.mn-net.com/automation
12
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention: : Le tampon MRB2 contient du sel chaotropique ! Porter des gants et des
lunettes !
•
Vérifier que tous les composants ne sont pas endommagés après avoir reçu le kit.
Si le contenu du kit, comme les bouteilles de tampon, est endommagé, contactez
l’assistance technique et le service clientèle de MACHEREY‑NAGEL ou votre
distributeur local.
•
N’utiliser pas les composants du kit endommagés.
•
La rDNase lyophilisée est expédiée à température ambiante dans le kit. Conserver
la rDNAse lyophilisée (RNase-free) à 4 °C dès son arrivée (stable jusqu’à : voir
l’étiquette du kit).
•
Tous les autres composants du kit doivent être conservés à une température
comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le
stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels.
•
Après la première utilisation, conserver la protéinase K liquide à 4 °C ou -20 °C.
•
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
•
Avant de débuter le protocole NucleoMag® RNA Blood,préparer les éléments
suivants : Éthanol à 80 % (pour les étapes de lavage)
•
Solution de travail de la rDNase : Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free à chaque
flacon de rDNase et incuber pendant 1 min à température ambiante. Agiter
doucement les flacons pour dissoudre complètement la rDNase. Veiller à ne pas
mélanger vigoureusement la rDNase car elle est sensible à l’agitation mécanique. Si
elle n’est pas complètement utilisée, cette solution de travail peut être conservée à
-20 °C pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler/décongeler la solution de travail
de la rDNase plus de trois fois.
•
Mélange réactionnel pour la rDNase : Ajouter 9,2 mL de tampon de réaction pour
la rDNase à 800 μL de solution de travail pour la rDNase et mélanger. Le mélange
réactionnel pour la rDNase résultante sera suffisant pour 32 extractions et devrait
être utilisé dans sa totalité. Si vous effectuez moins de 32 réactions, préparer une
plus petite quantité du mélange réactionnel. Pour chaque extraction, combiner
276 μL de tampon de réaction pour la rDNase avec 24 μL de solution de travail pour
la rDNase.
NucleoMag® RNA Blood
REF
rDNase (lyophilized)
1 × 96 preps
744352.1
4 × 96 preps
744352.4
3 flacons (taille D)
Ajouter 800 μL de H2O
RNase-free à chaque
flacon.
12 flacons (taille D)
Ajouter 800 μL de H2O
RNase-free à chaque
flacon.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
13
NucleoMag® RNA Blood
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® RNA Blood, portez des vêtements de
protection appropries (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection).
Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (les
FDS sont disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Ce manuel fournit des instructions détaillées spécifiques à l’utilisation du kit NucleoMag®
RNA Blood. Pour les consignes de sécurité relatives aux tubes collecteurs de sang
utilisés, veuillez-vous référer au manuel d’utilisation correspondant. En outre, consultez
les fiches de données de sécurité fournies pour prendre connaissance de tous les
produits chimiques contenus dans ces tubes. Les instructions générales de sécurité et
de manipulation se trouvent dans le manuel d’utilisation correspondant au tube collecteur
de sang.
Attention : Les échantillons biologiques sont susceptibles de transmettre des maladies
infectieuses. Les déchets générés par le kit NucleoMag® RNA Blood n’ont pas été testés
pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets
liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison des
conditions de lyse rigoureuses, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent,
les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés
et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Elimination des matériaux dangereux, infectieux ou biologiquement contaminés de
manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales.
14
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
5
Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans
des tubes collecteurs S-Monovette® RNA Exact
de SARSTEDT ou DNA/RNA Shield™Blood de
Zymo Research.
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.3, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 17.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Lyse de l’échantillon
820 µL de tubes collecteurs
S-Monovette® RNA Exact ou
DNA/RNA Shield™ Blood.
15 μL de protéinase K liquide
Mélanger par pipetages
successifs ou par agitation.
Incuber pendant 15 min à
température ambiante
2
Fixation de l’ARN aux
NucleoMag® B-Beads
15 μL NucleoMag® B-Beads
140 μL MRB1
Mélanger en agitant
pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
3
Lavage avec le
tampon MRB2
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
900 μL MRB2
Remettre en suspension :
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
15
NucleoMag® RNA Blood
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
4
Lavage avec le
tampon à 80 %
d’éthanol
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
900 μL Éthanol à 80
Resuspend: Shake 5 min at RT
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
Sécher pendant 5 min à TA
5
Digestion de l’ADN
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
300 μL
de mélange réactionnel
rDNase
Mélanger
Incuber 15 min à TA
6
Re-fixation
250 μL MRB1
Mélanger en agitant
pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
16
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
7
Lavage avec le
tampon à 80 %
d’éthanol
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
900 μL Éthanol à 80
Remettre en suspension :
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
8
Séchage de
l’échantillon
Laisser le Square-well Blocks
sur le NucleoMag® SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
9
Elution de l’ARN
Retirer le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
50 – 100 μL H₂O RNase-free
Agiter 5 – 10 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Séparer 2 min et transférer
l’ARN dans une plaque
d’élution / ​tubes.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
17
NucleoMag® RNA Blood
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par
exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3). Il
est recommandé d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe 1.2).
L’extraction de l’ARN peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des
séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle
et sert de ligne directrice pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés. Pour plus
d’informations sur l’automatisation, veuillez-vous référer au chapitre 2.8.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Lyse de l’échantillon
Prélever à la pipette 820 µL de sang dans un tube collecteur S-Monovette®
RNA Exact de SARSTEDT ou DNA/RNA Shield™ Blood de Zymo Research
et ajouter 15 µL de protéinase K liquide.
Mélanger par pipetages successifs 6 fois ou par agitation.
Incuber 15 min à température ambiante
2
Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads
Ajouter 15 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 140 μL
de tampon MRB2 à l’échantillon lysé. Mélanger en agitant pendant 5 min à
température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois, et incuber pendant
5 min à température ambiante.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les prélevés
du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce
qu’une suspension homogène se forme.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min
jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le
surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant.
Note: Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant.
Le culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de
l’autre côté du puits.
18
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
3
Lavage avec le tampon MRB2
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon MRB2 dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
4
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage.
5
Digestion de l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par
pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas
séparer les billes !
6
Re-fixation
Ajouter 250 μL de tampon MRB1 à chaque échantillon. Mélanger en agitant
pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et
incuber pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min
jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le
surnageant à l’aide d’une pipette.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
19
NucleoMag® RNA Blood
7
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
8
Séchage de l’échantillon
Sécher les billes à l’air pendant 10 à 15 min à température ambiante. Laisser le
Square-well Blocks sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
9
Elution de l’ARN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume défini de H2O RNase-free (50 – 100 μL) et remettre les billes
en suspension en agitant jusqu’à ce qu’elles soient complètement remises en
suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant
l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir les informations de
commande, paragraphe 8.2).
20
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
6
Extraction d’ARN à partir de sang collecté dans
des tubes Tempus™ Blood RNA
•
Du tampon de lyse DL (REF 740202.32, voir les informations de commande) et de
l’eau RNase-free (p.e. REF 740378.10000) supplémentaires sont nécessaires et ne
sont pas inclus dans le kit NucleoMag® RNA Blood.
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 1.3.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 24.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Verser tout le contenu du tube
Tempus™ Blood RNA dans un
tube conique de 50 mL.
Dilution de
l’échantillon
Ajouter 3 mL de PBS dans le
tube, fermer le couvercle.
Mélanger pendant 30 secondes
en vortexant vigoureusement.
2
Concentration de
l’ARN
Centrifuger pendant 30 min à
3000 à 4400 × g à 4 °C
Eliminer doucement le
surnageant
Laisser le tube renversé sur un
papier absorbant pendant 1 min,
éponger le liquide restant sur les
bords du tube.
Note: Manipuler chaque tube
avec précaution pour éviter de
perturber le culot d’ARN non
purifié déposé au fond du tube.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
21
NucleoMag® RNA Blood
3
Redissoudre l’ARN
Ajouter 620 µL de tampon DL
Vortexer ou remettre en
suspension l’ARN du fond du
tube par pipetage.
4
Lyse de l’échantillon
Prédispenser 200 µL d’eau
RNase-free (non fournie dans
le kit)
620 µL de culot d’ARN remis en
suspension
Mélanger par pipetages
successifs ou par agitation.
15 μL de protéinase K liquide
Mélanger par pipetages
successifs ou par agitation.
Incuber pendant 15 min à
température ambiante
5
Fixation de l’ARN aux
NucleoMag® Beads
15 μL NucleoMag® B-Beads
140 μL MRB1
Mélanger en agitant
pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
6
Lavage avec le
tampon MRB2
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
900 μL MRB2
Remettre en suspension :
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
22
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
7
Lavage avec le
tampon à 80 %
d’éthanol
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
900 μL Éthanol à 80
Remettre en suspension :
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
Sécher pendant 5 min à TA
8
Digest DNA
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
300 μL de mélange réactionnel
rDNase
Mélanger
Incuber 15 min à TA
9
Re-fixation
250 μL MRB1
Mélanger en agitant
pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
23
NucleoMag® RNA Blood
10
Lavage avec le
tampon à 80 %
d’éthanoll
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
900 μL Éthanol à 80
Remettre en suspension :
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
11
Séchage de
l’échantillon
Laisser le Square-well Blocks
sur le
NucleoMag® SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
12
Elution de l’ARN
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
50 – 100 μL H2O RNase-free
Agiter 5 – 10 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Séparer 2 min et transférer
l’ARN dans une plaque
d’élution / ​tubes.
24
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par
exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3).
Il est recommandé d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe
1.2). Alternativement, l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction
avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation
manuelle et sert de ligne directrice pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés.
Pour plus d’informations sur l’automatisation, veuillez-vous référer au chapitre 2.8.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Dilution des échantillons
Verser la totalité du contenu - environ 9 mL - d’un tube Tempus™ Blood RNA
dans un tube conique de 50 mL.
Ajouter 3 mL de PBS au tube pour obtenir un volume total de 12 mL, fermer le
couvercle.
Mélanger pendant 30 secondes en vortexant vigoureusement.
2
Concentration de l’ARN
Centrifuger pendant 30 min à 3000 à 4400 x g à 4 °C à l’aide d’un rotor oscillant
afin de concentrer l’ARN au fond du tube.
Eliminer le surnageant
Note: Le culot d’ARN est invisible. Eliminer le surnageant très soigneusement
afin de ne pas perdre le culot d’ARN. Éliminer les déchets conformément à la
réglementation locale.
Poser le tube à l’envers sur un papier absorbant et le laisser reposer pendant
1 min. Épongez le liquide restant sur le bord du tube en le tamponnant très
soigneusement sur le papier.
Redissoudre l’ARN
Ajouter 620 µL de tampon DL au fond du tube
Vortexer ou remettre en suspension l’ARN au fond du tube par pipetage.
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25
NucleoMag® RNA Blood
3
Lyse de l’échantillon
Distribuer au préalable 200 µL d’eau RNase-free dans un nouveau tube de
réaction (non fourni).
Transférer le culot d’ARN de 620 µL remis en suspension dans le tampon DL
dans le nouveau tube de réaction.
Mélanger par pipetages successifs ou agiter avant d’ajouter la protéinase K
liquide.
Ajouter 15 μL de protéinase K liquide.
Mélanger par pipetages successifs ou par agitation.
Incuber pendant 15 min à température ambiante
4
Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads
Ajouter 15 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 140 μL
de tampon MRB1 à l’échantillon lysé. Mélanger par agitation pendant 5 min à
température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois, et incuber pendant
5 min à température ambiante.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de prélever
dans le flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à
ce qu’une suspension homogène soit obtenue.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min
jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le
surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant.
Note: Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant. Le
culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de
l’autre côté du puits.
5
Lavage avec le tampon MRB2
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon MRB2 dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
26
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
6
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Squarewell Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de
séchage.
7
Digestion de l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension
par pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
Ne pas séparer les billes !
8
Re-fixation
Ajouter 250 μL de tampon MRB1 à chaque échantillon. Mélanger par agitation
pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et
incuber pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min
jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter
le surnageant à l’aide d’une pipette.
9
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
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NucleoMag® RNA Blood
10
Séchage de l’échantillon
Sécher les billes à l’air pendant 10 à 15 min à température ambiante. Laisser le
Square-well Blocks sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
11
Elution de l’ARN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume désiré de H2O RNase-free (50 – 100 μL) et remettre les billes
en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant
l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir les informations de
commande, paragraphe 2.6).
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MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
7
Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans
des tubes collecteurs EDTA / ​Citrate
•
Des tampons de lyse DL (REF 740202.32, voir les informations de commande) et
de lavage RAW (REF 740361.150) supplémentaires sont nécessaires et ne sont pas
inclus dans le kit NucleoMag® RNA Blood.
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 1.3.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 24.
Before starting the preparation:
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Lyse de
l’échantillon
260 µL de sang provenant de tubes
collecteurs EDTA ou citrate
540 µL DL
15 μL de protéinase K liquide
Mélanger par pipetages successifs ou
par agitation
Incuber pendant 15 min à température
ambiante
2
Fixation de
l’ARN aux
NucleoMag®
B-Beads
15 μL NucleoMag® B-Beads
160 μL MRB1
Mélanger en agitant pendant 5 min à
TA.
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
29
ARN à partir de sang
3
Lavage avec
le tampon
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
900 μL RAW
Remettre en suspension : Agiter 5 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
4
Lavage avec
le tampon
à 80 %
d’éthanol
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
900 μL d’éthanol à 80 %
Remettre en suspension : Agiter 5 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
Sécher pendant 5 min à TA
5
Digestion de
l’ADN
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
300 μL de mélange réactionnel rDNase
Mélanger
Incuber 15 min à TA
30
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
6
Re-fixation
250 μL MRB1
Mélanger en agitant pendant 5 min à
TA.
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
7
Lavage avec
le tampon
à 80 %
d’éthanol
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
900 μL d’éthanol à 80 %
Remettre en suspension : Agiter 5 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
8
Séchage de
l’échantillon
Laisser le Square-well Blocks sur le
NucleoMag® SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
31
ARN à partir de sang
9
Retirer
le Square-well Blocks
du NucleoMag® SEP
Elution de
l’ARN
50 – 100 μL H2O RNase-free
Agiter 5 – 10 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ARN dans
une plaque d’élution / ​tubes.
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par
exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3). Il
est recommandé d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe 1.2).
L’extraction de l’ARN peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des
séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle
et sert de ligne directrice pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés. Pour plus
d’informations sur l’automatisation, veuillez-vous référer au chapitre 2.8.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Lyse de l’échantillon
Prélever à la pipette 260 µL de sang dans un tube collecteur EDTA ou citrate et
ajouter 540 µL de tampon DL et 15 µL de protéinase K liquide.
Mélanger par pipetages successifs 6 fois ou par agitation.
Incuber 15 min à température ambiante
32
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
2
Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads
Ajouter 15 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 160 μL
de tampon MRB1 à l’échantillon lysé. Mélanger en agitant pendant 5 min à
température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et incuber pendant 5 min
à température ambiante.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les prélevé du
flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une
suspension homogène soit obtenue.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min
jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le
surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant.
Note: Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant. Le
culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de
l’autre côté du puits.
3
Lavage avec le tampon RAW
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon RAW dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
4
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
33
ARN à partir de sang
5
Digestion de l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par
pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas
séparer les billes !
6
Re-fixation
Ajouter 250 μL de tampon MRB1 à chaque échantillon. Mélanger par agitation
pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et
incuber pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min
jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le
surnageant à l’aide d’une pipette.
7
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
8
Séchage de l’échantillon
Sécher les billes à l’air pendant 10 à 15 min à température ambiante. Laisser le
Square-well Blocks sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
9
Elute RNA
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume désiré d’H2O RNase-free (50 – 100 μL) et remettre les billes
en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises
en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par
pipetages successifs (15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant
l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir les informations de
commande, paragraphe 8.2).
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MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
ARN à partir de sang
8
Annexes
8.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Contamination par la RNase
L’ARN est
dégradé / ​
aucun ARN
n’est obtenu
•
Créer un environnement de travail RNase-free. Porter des gants
pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants
fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes ou des
plaques en polypropylène stériles et jetables. La verrerie doit être
cuite au four pendant au moins 2 heures à 250 °C avant d’être
utilisée.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Le culot des billes doit être entièrement recouvert de tampon
d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape
d’élution.
•
Éliminer complètement les tampons résiduels lors des étapes
de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des
étapes de lavage et d’élution suivantes.
Séchage excessif des billes
•
Faible
rendement en
ARN
Ne pas laisser sécher les billes excessivement, car cela pourrait
entraîner une baisse de l’efficacité de l’élution.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du
surnageant, en particulier lorsque le culot de billes magnétiques
n’est pas visible dans le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
Durée de séparation magnétique trop courte ou vitesse
d’aspiration trop élevée.
•
Perte du culot d’ARN (Tempus™ Blood RNA Tube)
•
S’assurer que la force g et la durée de centrifugation sont
suffisantes et que la température est ajustée à 4 °C. Faire très
attention au surnageant. Laisser le tube inversé seulement
pendant 1 min sur le papier absorbant.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
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ARN à partir de sang
Problème
Causes possibles et suggestions
Procédure de lavage insuffisante
Pureté
insuffisante
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur
et de plaque, par exemple Square-well Block en combinaison
avec NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si l’agitation
n’est pas suffisante pour remettre les billes en suspension
complètement, mélanger en effectuant des pipetages
successifs.
Elimination de l’éthanol des tampons de lavage
Faible
performance
de l’ARN dans
les applications
en aval
•
Veillez à éliminer toute la solution de lavage éthanolique, car
l’éthanol résiduel interfère avec les applications en aval.
Pureté insuffisante
•
Voir ci-dessus.
Durée de séparation magnétique trop courte
•
Perte des billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes
d’être complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout
le liquide du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut
entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration
pour l’étape d’élution.
Contaminations des parties supérieures des puits
Contamination
croisée
36
•
Ne pas souiller les bords du Square-well Blocks lors du transfert
du lysat tissulaire. Si le bord des puits est contaminé, sceller le
Square-well Block avec une feuille PE auto-adhésive (voir les
informations de commande, paragraphe 6.2) avant de mettre
l’agitateur en marche.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
NucleoMag® RNA Blood
8.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag RNA Blood
744352.1
744352.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
Tampon de lyse DL
740202.32
100 mL
Tampon de lavage RAW
740361.150
150 mL
H2O RNase-free
740378.1000
1000 mL
NucleoMag SEP
744900
1
Square-well Blocks
740481.4
740481.24
4
24
Pour l’utilisation du kit sur l’instrument
KingFisher® Flex :
744951
1 set
®
®
p.e., 96-well Acessory Kit B for KingFisher®
(Square-well Blocks, Deep-well tip combs,
Plaques d’élution pour 4 × 96 NucleoMag® RNA
preps avec la plateforme KingFisher® Flex)
Tip combs 8 positions pour systèmes à barreaux 744960
magnétiques (Pour l’utilisation du kit NucleoMag®
RNA Blood sur l’instrument MagnetaPure 32 Plus
ou l’instrument IsoPure™ Mini).
50 pièces
744955
25 pièces
Plaques 96 puits profonds pour systèmes à
barreaux magnétiques (Pour l’utilisation du
kit NucleoMag® RNA Blood sur l’instrument
MagnetaPure 32 Plus ou l’instrument IsoPure™
Mini).
Pour toute commande ou demande de renseignements concernant le Magnetapure 32 Plus
ou l’appareil IsoPure™ Mini, veuillez contacter le service technique MACHEREY‑NAGEL.
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le
produit.
MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02
37
NucleoMag® RNA Blood
8.3
Restrictions d’utilisation du produit / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes
de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du
produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et
descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants
de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par
un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et
elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la
société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les
descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre
d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel. : +49 24 21 969‑333
support@mn-net.com
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NucleoMag® RNA Blood
Marques déposées :
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL.
KingFisher® est une marque déposée de Thermo Scientific Inc.
Tempus™ est une marque déposée d’Applied Biosystems par Thermo Fisher Scientific.
DNA/RNA Shield™ est une marque déposée de Zymo Research Corporation.
Monovette® est une marque déposée de SARSTEDT.
IsoPure™ est une marque d’Accuris Instruments.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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A0xxxxx/113
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