Macherey-Nagel NucleoBond® Finalizer Manuel utilisateur

Plasmid DNA
purification
Excerpt from user manual
- Français NucleoBond® Xtra Midi
NucleoBond® Xtra Maxi
NucleoBond® Xtra Midi Plus
NucleoBond® Xtra Maxi Plus
January 2013 / Rev. 11
Plasmid DNA purification – Français
Introduction
Purification de l’ADN plasmidique avec les kits NucleoBond®
Xtra Midi (Plus) et Maxi (Plus)
En ce qui concerne ce protocole il s’agit d’un extrait en français du manuel “Plasmid
DNA Purification, NucleoBond® Xtra“.
Il décrit étape par étape le protocole de purification qui se trouve dans le manuel, en
anglais, au chapitre 7.
Les informations détaillées concernant les kits NucleoBond® Xtra ainsi que la procédure
de purification (Ex. culture des cellules bactériennes, lyse des cellules, étapes de la
purification, stockage des composants du kit, fabrication des tampons et des réactifs,
indications de sécurité, troubleshooting) se trouvent dans le manuel en anglais.
Il est recommandé pour les utilisateurs qui utilisent le kit pour la première fois de lire
complètement le manuel d’utilisation.
Les utilisateurs expérimentés peuvent travailler directement avec les protocoles
spécifiques.
7 NucleoBond® Xtra – purification d’ADN plasmidique
4
7.1 Purification de plasmides high-copy (Midi, Maxi)
4
7.2 Purification de plasmides low-copy (Midi, Maxi)
11
7.3 Concentration des éluats NucleoBond® Xtra avec NucleoBond® Finalizer 15
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
3
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
7
NucleoBond® Xtra – purification d’ADN
plasmidique
7.1 Purification de plasmides high-copy (Midi, Maxi)
Remarque : Les renvois dans le protocole se réfèrent aux chapitres correspondant
dans le procotole principal en anglais.
Midi
1
Maxi
Préparation d’une pré-culture
Inoculez 3–5 mL d’un milieu de pré-culture LB avec une colonie piquée sur une
plaque d’Agar fraîchement striée. Assurez-vous que la plaque et le milieu de
culture contiennent le bon antibiotique afin d’être sûr d’obtenir le plasmide (pour
d’autres informations voir section 4.3). Agitez à 37 °C à ~ 300 rpm pendant ~ 8 h.
2
!
Préparation d’une culture overnight
Remarque : Afin d’utiliser au maximum la capacité de fixation des colonnes
NucleoBond® Xtra il est nécessaire de charger une grande quantité d’ADN
plasmidique. Si la culture présente une faible croissance ou si le plasmide ne
se comporte pas comme un plasmide high-copy, consultez la section 4.6 du
protocole pour l’utilisation de plus grands volumes de culture. Si vous n’êtes
pas sûr du nombre de copies de votre plasmide ou du comportement de la
culture vis à vis de la croissance bactérienne, augmentez le volume de culture
et décidez à l’étape 3 du nombre de cellules à utiliser pour la préparation. Le
volume mentionné ci-après de la culture overnight est calculé pour la valeur de
l’OD600 de 4 (voir chapitre 4.5 comme référence).
Inoculez une culture overnight en diluant la pré-culture au 1/1000ième dans un
volume donné de milieu LB contenant l’antibiotique sélectif approprié. Faites
pousser la culture toute la nuit à 37 °C à ~ 300 rpm pendant 12–16 h.
100 mL
3
300 mL
Récupération des cellules bactériennes
Mesurez la DO600 de la culture cellulaire et déterminez le volume de culture
recommandé.
V [mL] =
400 / OD600
4
V [mL] =
1200 / OD600
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
Maxi
Culottez les cellules par centrifugation à 4,500–6,000 x g pendant ≥ 10 min à
4 °C et éliminez complètement le surnageant.
Remarque : Il est possible, bien sûr, d’utiliser de plus grands volumes, par ex. si le
plasmide ne se comporte pas comme un vecteur high-copy (voir section 4.6 pour plus
d’informations). Dans ces conditions il est nécessaire d’augmenter proportionnellement
les volumes des tampons RES, LYS et NEU dans les étapes 4, 5 et 7. Èventuellement,
il faudra commander un volume supplémentaire de tampon de lyse (voir I’information
de commande du NucleoBond® Xtra Buffer Set I). Si le volume de culture est plus du
double du volume recommandé, il est plus judicieux de centrifuger pour clarifier le
lysat (étape 8), plutôt que d’utiliser le filtre NucleoBond® Xtra.
4
Resuspension (Buffer RES)
Rependre complètement le culot cellulaire dans le tampon de resuspension
Resuspension Buffer RES + RNase A en pipettant par aspiration-refoulement
ou en vortexant.
Important : pour une lyse efficace des cellules il ne doit plus subsister d’agrégats
en suspension.
Remarque : Augmentez proportionnellement le volume du tampon RES si vous avez
utilisé une masse cellulaire supérieure à celle recommandée (voir la section 4.7 pour
plus d ‘informations sur les conditions de lyse optimales des cellules et la section 4.8
pour les souches difficiles à lyser).
8 mL
12 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
5
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
5
!
Maxi
Lyse cellulaire (Buffer LYS)
Avant d’utiliser le tampon LYS vérifiez que le SDS n’a pas précipité. Si
un précipité blanc est visible, chauffez le tampon quelques minutes à 30–40 °C
jusqu’à ce que le précipité soit complètement dissout. Ramenez le tampon à
température ambiante (18–25 °C).
Ajoutez le tampon de lyse Lysis Buffer LYS à la suspension.
Mélangez avec précaution en inversant le tube 5 fois. Ne pas utiliser de
vortex, sinon l’ADN chromosomique se fractionnerait, se détacherait des débris
cellulaires et contaminerait alors la suspension.
Incubez le mélange à température ambiante (18–25 °C) pendant 5 min.
Attention : Un temps d’incubation trop long sous des conditions alcalines peut
dénaturer et dégrader irréversiblement l´ADN plasmidique et libérer l´ADN
chromosomique dans le lysat.
Remarque : Augmentez proportionnellement le volume du tampon LYS si vous avez
utilisé une masse cellulaire supérieure à celle recommandée (voir section 4.7 pour
plus d’informations sur la lyse optimale des cellules).
8 mL
6
12 mL
Equilibration (Buffer EQU)
Equilibrez la colonne NucleoBond® Xtra avec
le filtre intégré avec le tampon d’équilibration
Equilibration Buffer EQU.
Déposez le tampon sur la collerette du filtre
comme le montre le schéma et assurez-vous
que le filtre est entièrement mouillé.
Laissez la colonne se vider par gravité. La
colonne ne s’assèche pas.
12 mL
6
25 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
7
!
Maxi
Neutralisation (Buffer NEU)
Ajoutez le tampon de neutralisation Neutralization Buffer NEU à la suspension
et mélangez immédiatement avec précaution le lysat en inversant le tube 10–15
fois. Ne pas utiliser de vortex.
Le flacon ou le tube utilisé pour cette étape ne doit pas être rempli au plus
des deux tiers afin de permettre un mélange homogène. Veillez à neutraliser
complètement pour précipiter toutes les protéines et l’ADN chromosomique. Le
lysat doit passer d’une forme gluante et visqueuse à une forme moins visqueuse,
une suspension homogène et un floculat blanc.
Procédez immédiatement à l’étape 8. Une incubation du lysat n’est pas
nécessaire.
Remarque : Augmentez proportionnellement le volume du tampon NEU si vous avez
utilisé une masse cellulaire supérieure à celle recommandée (voir section 4.7 pour
des informations sur la lyse optimale des cellules).
8 mL
8
!
12 mL
Clarification et chargement
Assurez-vous d’avoir une suspension homogène du précipité en inversant le
tube 3 fois avant d’appliquer directement le lysat sur le filtre NucleoBond® Xtra
préalablement équilibré, afin d’éviter que le filtre ne se bouche.
Le lysat est simultanément clarifié et chargé sur la colonne. Rechargez le filtre si
le volume de lyse est plus important que la capacité du filtre. Laissez la colonne
se vider par gravité.
Alternative : Le précipité peut être éliminé par centrifugation ≥ 5,000 x g pendant
au moins 10 min, par ex. si plus du double de la masse cellulaire recommandée
a été utilisé. S’ il reste des matières en suspension, transférez dans un nouveau
tube et répétez l’étape de centrifugation, de préférence à une vitesse plus élevée,
ou chargez le lysat sur le filtre NucleoBond® Xtra préalablement équilibré.
Cette étape de clarification est extrêmement importante. En effet, les résidus du
précipité peuvent boucher la colonne NucleoBond® Xtra. Pour charger la colonne
vous pouvez appliquer le lysat clarifié sur le filtre préalablement équilibré ou
enlever préalablement le filtre s’il est inutilisé. Laissez la colonne se vider par
gravité.
Remarque : Vous pouvez garder tous les filtrats pour les analyser (voir section 8.1)
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
7
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
9
!
Lavage du filtre et de la colonne (Buffer EQU)
Lavez le filtre NucleoBond® Xtra et la colonne
NucleoBond® Xtra avec le tampon Equilibration
Buffer EQU.
Déposez le tampon sur la collerette du filtre et
assurez-vous que le lysat est bien lavé. Omettre
cette étape ou déposer simplement le tampon dans
le filtre réduit le rendement d’ADN plasmidique.
5 mL
10
Maxi
15 mL
Eliminer le filtre
Retirez le filtre NucleoBond® Xtra ou éliminez le en retournant
la colonne.
11
!
Lavage de la colonne (Buffer WASH)
Lavez la colonne NucleoBond® Xtra avec le tampon de lavage
Wash Buffer WASH. Il est important d’éliminer le filtre avant
d’appliquer le tampon de lavage. En effet, ceci pourrait avoir un
mauvais impact sur la pureté de l’ADN.
8 mL
8
25 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
12
Maxi
Elution (Buffer ELU)
Eluez l’ADN plasmidique avec le tampon d’élution Elution Buffer ELU. Collectez
le tampon d’élution avec l’ADN plasmidique dans un tube de centrifugation de
15 mL ou 50 mL.
Remarque : Chauffer tampon d’élution ELU à 50 °C avant l’élution peut améliorer le
rendement d’ADN plasmidique de gros taille comme des BACs.
Passez à l’étape 13 pour le protocole de centrifugation après la précipitation à
l’ isopropanol ou continuez avec la section 7.9 pour la concentration de l’ADN
plasmidique et son désalage au moyen du système NucleoBond® Finalizer
(NucleoBond® Xtra Midi Plus) ou NucleoBond® Finalizer Large (NucleoBond®
Xtra Maxi Plus).
Option : Déterminez le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV afin
d’ajuster la concentration de l’ADN à l’étape 15 et calculez le taux de récupération
après l’étape de précipitation.
5 mL
13
15 mL
Précipitation
Ajoutez l’isopropanol à température ambiante pour précipiter l’ADN
plasmidique élué.
Vortexez précautionneusement.
Centrifugez à ≥ 5,000 x g pendant ≥ 5 min à ≤ température ambiante, de
préférence à 15,000 x g pendant 30 min à 4 °C. Eliminez précautionneusement
le surnageant.
3.5 mL
14
10.5 mL
Lavage et séchage du culot d’ADN
Ajoutez l’éthanol 70 % à température ambiante sur les culots.
2 mL
5 mL
Centrifugez à ≥ 5,000 x g, de préférence ≥ 15,000 x g pendant 5 min à
température ambiante (18–25 °C).
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
9
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
Maxi
Eliminez précautionneusement l’éthanol complètement avec une pipette.
Laissez sécher le culot à température ambiante (18–25 °C).
Remarque : l’ADN plasmidique peut être plus difficile à dissoudre si le culot est très
sec.
5–10 min
15
10–15 min
Reconstitution de l’ADN
Dissoudre le culot d’ADN dans un volume adéquat de tampon TE ou d’eau
stérile. En fonction du type de tube utilisé pour la centrifugation, dissoudre par
aspiration - refoulement ou par rotation constante dans un volume approprié de
tampon pendant 10–60 min (3D-shaker).
Déterminez le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV.
Confirmez l’intégrité du plasmide par électrophorèse sur gel d’agarose (voir la
section 4.13).
10
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
7.2 Purification de plasmides low-copy (Midi, Maxi)
Remarque : Les renvois dans le protocole se réfèrent aux chapitres correspondant
dans le procotole principal en anglais.
Le volume de tampon de lysis contenu dans le kit est calculé pour la purification
d´ADN plasmidique high-copy. En conséquence, il faut commander des tampons
supplémentaires pour la purification continue d´ADN plasmidique low-copy (voir section
8.2 sur l´information de commande).
Midi
1
Maxi
Préparation d’une pré-culture
Inoculez 3–5 mL d’un milieu de pré-culture LB avec une colonie piquée sur une
plaque d’Agar fraîchement striée. Assurez-vous que la plaque et le milieu de
culture contiennent le bon antibiotique afin d’être sûr d’obtenir le plasmide (pour
d’autres informations voir sections 4.3). Agitez à 37 °C à ~ 300 rpm pendant
~ 8 h.
2
!
Préparation d’une culture overnight
Remarque : Afin d’utiliser au maximum la capacité de fixation des colonnes
NucleoBond® Xtra il est nécessaire de charger une quantité suffisante d’ADN
plasmidique. Pour le protocole low-copy standard, le volume de culture recommandé
est doublé par rapport au protocole high-copy. Cependant, étant donné que le contenu
plasmidique des cellules peut être 10–100 fois inférieur, le volume de culture peut
être insuffisant. Si vous avez besoin de grandes quantités de plasmides low-copy,
augmentez à nouveau le volume de culture d’un facteur 3–5 (voir la section 4.6 pour
plus d’informations) et décidez à l’étape 3 de la quantité de cellules à utiliser pour la
préparation. Le volume mentionné ci-après de la culture overnight est calculé pour la
valeur de l’OD600 de 4 (voir chapitre 4.6 comme référence).
Inoculez une culture overnight en diluant la pré-culture au 1/1000ième dans un
volume donné de milieu LB contenant l’antibiotique sélectif approprié. Faites
pousser la culture toute la nuit à 37 °C à ~ 300 rpm pendant 12–16 h.
200 mL
600 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
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NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
3
Maxi
Récupération des cellules bactériennes
Mesurez la DO600 de la culture cellulaire et déterminez le volume de culture
recommandé.
V [mL] =
800 / OD600
V [mL] =
2400 / OD600
Culottez les cellules par centrifugation à 4,500–6,000 x g pendant ≥ 10 min à
4 °C et éliminez le surnageant complètement.
Remarque : il est possible, bien sûr, d’utiliser de plus grands volumes de culture, par
ex. si un grande quantité de plasmides low-copy doit être récupérée, (voir la partie
4.6 pour plus d’informations). Dans ce cas, augmentez les volumes des tampons
RES, LYS et NEU proportionnellement aux étapes 4, 5 et 7. Èventuellement, il
faudra commander un volume supplémentaire de tampon de lyse (voir I’information
de commande du NucleoBond® Xtra Buffer Set I). Utilisez la centrifugation pour la
clarification du lysat plutôt que les colonnes filtres NucleoBond® Xtra.
4
Resuspension (Buffer RES)
Rependre complètement le culot cellulaire dans le tampon de resuspension
Resuspension Buffer RES + RNase A en pipettant par aspiration-refoulement
ou en vortexant.
Important: pour une lyse efficace des cellules il ne doit plus subsister d’agrégats
en suspension.
Remarque : augmentez proportionnellement le volume de tampon RES si vous avez
utilisé une masse cellulaire supérieure à celle recommandée (voir la section 4.7 pour
plus d ‘informations sur les conditions de lyse optimales des cellules et la section 4.8
pour les souches difficiles à lyser).
16 mL
12
24 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
5
!
Maxi
Lyse cellulaire (Buffer LYS)
Avant d’utiliser le tampon LYS vérifiez que le SDS n’a pas précipité. Si un
précipité blanc est visible, chauffer le tampon quelques minutes à 30–40 °C
jusqu’à ce que le précipité soit complètement dissout. Ramenez le tampon à
température ambiante (18–25 °C).
Ajoutez le tampon de lyse Lysis Buffer LYS à la suspension.
Remarque : augmentez proportionnellement le volume de tampon LYS si vous avez
utilisé une masse cellulaire supérieure à celle recommandée (voir la section 4.7 pour
plus d ‘informations sur la lyse optimale des cellules).
16 mL
24 mL
Mélangez avec précaution en inversant le tube 5 fois. Ne pas utiliser de
vortex, sinon l’ADN chromosomique se fractionnerait, se détacherait des débris
cellulaires et contaminerait alors la suspension.
Incubez le mélange à température ambiante (18–25 °C) pendant 5 min.
Attention : Un temps d’incubation trop long sous des conditions alcalines peut
dénaturer et dégrader irréversiblement l´ADN plasmidique et libérer l´ADN
chromosomique dans le lysat.
6
Equilibration (Buffer EQU)
Equilibrez la colonne NucleoBond® Xtra avec
le filtre intégré avec le tampon d’équilibration
Equilibration Buffer EQU.
Déposez le tampon sur la collerette du filtre
comme le montre le schéma et assurez vous
que le filtre est entièrement mouillé.
Laissez la colonne se vider par gravité. La
colonne ne s’assèche pas.
12 mL
25 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
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NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi
7
!
Maxi
Neutralisation (Buffer NEU)
Ajoutez le tampon de neutralisation Neutralization Buffer NEU à la suspension
et mélangez immédiatement avec précaution le lysat en inversant le tube 10–15
fois. Ne pas utiliser de vortex.
Le flacon ou le tube utilisé pour cette étape ne doit pas être rempli au plus
des deux tiers afin de permettre un mélange homogène. Veillez à neutraliser
complètement pour précipiter toutes les protéines et l’ADN chromosomique. Le
lysat doit passer d’une forme gluante et visqueuse à une forme moins visqueuse,
une suspension homogène et un floculat blanc.
Passez à l’étape 8 du protocole de purification des plasmides high-copy, section
7.7. Une incubation du lysat n’est pas nécessaire.
Remarque : augmentez proportionnellement le volume de tampon NEU si vous avez
utilisé une masse cellulaire supérieure à celle recommandée (voir la section 4.7 pour
plus d’informations sur la lyse optimale des cellules).
16 mL
14
24 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
7.3 Concentration des éluates NucleoBond® Xtra avec
NucleoBond® Finalizer
Remarque : Les renvois dans le protocole se réfèrent aux chapitres correspondant
dans le procotole principal en anglais.
Utilisez les NucleoBond® Finalizers seulement pour les vecteurs inferieur à 50 kbp.
Midi - NucleoBond®
Finalizer
1
Maxi - NucleoBond®
Finalizer Large
Précipitation de l’ADN
Remarque : Contrôler la concentration en ADN avant la précepitation. Vérifier le
contenu d’ADN plasmidique de vos éluats avant de passer à l’étape de précipitation
en mesurant A260 (voir la section 4.13).
Ajoutez 0.7 volumes d’isopropanol à température ambiante (non fourni dans
les kits). Vortexez précautionneusement et laissez le mélange reposer pendant
2 minutes.
(ex. pour 5 mL d’éluat NucleoBond® Xtra Midi ajoutez 3.5 mL d’isopropanol, pour
15 mL d’éluat NucleoBond® Xtra Maxi, ajoutez 10.5 mL d’isopropanol)
3.5 mL pour
5 mL d’éluat
2
10.5 mL pour
15 mL d’éluat
Chargement du précipité
Enlevez le piston de la seringue 30 mL et fixez un NucleoBond® Finalizer en
sortie.
Versez le mélange de précipitation dans la seringue, insérez le piston, gardez
la seringue en position verticale, et pressez le mélange afin de le faire passer
doucement à travers le NucleoBond® Finalizer en utilisant une force minimale.
Eliminez le filtrat.
3
Lavage du précipité
Enlevez le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirez le piston et rattachez le
NucleoBond® Finalizer à la sortie de la seringue.
Versez d’éthanol 70 % (non fourni dans les kits) dans la seringue, insérez le
piston, gardez la seringue en position verticale, et pressez l’éthanol doucement
à travers le NucleoBond® Finalizer. Eliminez l‘éthanol.
2 mL
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
5 mL
15
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi - NucleoBond®
Finalizer
4
Maxi - NucleoBond®
Finalizer Large
Séchage de la membrane
Enlevez le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirez le piston et rattachez le
NucleoBond® Finalizer. Faites passer de l’air à travers le NucleoBond® Finalizer
tout en touchant un tissus ou papier propre avec la pointe du NucleoBond®
Finalizer pour absorber l’éthanol aussi fort que possible.
Répétez cette étape au moins les fois déclarés en bas jusqu’à ce que plus
aucune goutte d’éthanol ne sorte du NucleoBond® Finalizer.
Remarque : une nouvelle seringue sèche peut être utilisée pour accélérer la procédure
(non fournie).
≥ 3 fois jusqu’à ce
que ce asoit sec
≥ 6 fois jusqu’à ce
que ce soit sec
Option : vous pouvez incuber NucleoBond® Finalizer pendant 10 minutes à 80 °C pour
minimiser la contamination éthanolique. Cependant, le taux de récupération final peut
être réduit en raison d’un séchage excessif de l’ADN.
5
Elution de l’ADN
Enlevez le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirez le piston d’une seringue
1 mL et fixez le NucleoBond® Finalizer à la sortie.
Remarque : voir la section 4.12, Tableau 4 (Midi) ou 5 (Maxi) pour choisir le volume
approprié de tampon d’élution.
Pipetez un volume approprié de tampon d’élution Buffer TRIS (5 mM Tris/HCl,
pH 8.5, fourni dans le kit) ou le tampon TE (voir la section 4.12) dans la seringue.
Placez la pointe du NucleoBond® Finalizer en position verticale au dessus d”un
nouveau tube collecteur et éluez goutte à goutte l’ADN plasmidique en
insérant le piston.
200–800 μL
!
Enlevez le NucleoBond® Finalizer de la seringue, retirez le piston et rattachez le
NucleoBond® Finalizer à la sortie de la seringue.
Transférez le premier éluat dans la seringue et éluez dans le même tube
collecteur une seconde fois.
Charger
complètement le
premier éluat
16
400–1000 μL
Charger
complètement le
premier éluat
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
NucleoBond® Xtra Midi / Maxi – Français
Midi - NucleoBond®
Finalizer
Maxi - NucleoBond®
Finalizer Large
Retirer le NucleoBond® Finalizer de la seringue, remonter le piston de la seringue
pour aspirer de l’air, remettre en place le NucleoBond® Finalizer et presser l’air
pour expulser le maximum d’éluat.
Déterminez le rendement d’ADN plasmidique par spectrophotométrie UV et
confirmez l’intégrité du plasmide par électrophorèse sur gel d’agarose (voir
section 4.12)
MACHEREY-NAGEL – 01 / 2013, Rev. 11
17
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