Leçon 2 : électrophorèse sur gel d’agarose et visualisation des fragments d’ADN
Préparation
Objectifs
Temps nécessaire
Fournitures nécessaires
ADN de lambda digéré avec HindIII (marqueur ADN)
Tampon de charge
Chambres d’électrophorèse, plateau et peignes
Tampon d’électrophorèse (TAE 1x)
Colorant ADN Fast Blast, 500x
Procédures
1.
Préparer l'ADN lambda digéré avec HindIII (marqueur d’ADN) et distribuer (en option)
Distribuer le tampon de charge d’ADN (en option)
Préparer la chambre d’électrophorèse
Diluer du Fast Blast à 1x (pour une coloration sur toute la nuit) ou 100x
(pour une coloration rapide) ;
Préparer les postes de travail des élèves et du professeur.
45 minutes
2.
3.
Préparer l’ADN lambda digéré avec HindIII (marqueur ADN) et distribuer (en option).
Ajouter 20 µl de tampon de charge au tube de référence contenant le marqueur ADN lambda digéré avec HindIII . Si possible, chauffer le marqueur à 65°C pendant 5 minutes, puis refroidir sur de la glace ; ceci permet d'obtenir une meilleure séparation des bandes de marqueur.
Étiqueter des microtubes (non fournis) avec un « M ». Ajouter 15 µl de marqueurs d’ADN contenant le tampon de charge dans 8 micro tubes étiquetés « M ».
Distribuer le tampon de charge. Étiqueter huit microtubes (non fournis) « TC » pour déposer le colorant et ajouter 30 µl de tampon de charge dans chaque tube. Distribuer un tube à chaque groupe.
b.
c.
d.
Préparer la chambre d’électrophorèse. Lorsque le gel d’agarose est solidifié, on peut commencer le dépôt d’échantillons et l’électrophorèse.
a.
Lorsque l’on place le plateau dans la chambre l’électrophorèse, vérifier que les puits d’échantillon sont à l’extrémité cathode noire. Durant l’électrophorèse, les échantillons migreront vers l’extrémité de l’anode rouge.
Préparer le volume requis de tampon TAE 1x si vous ne l’avez pas déjà préparé.
Plonger le gel dans environ 2 mm de tampon TAE 1x.
Préparer les échantillons pour la charge du gel.
Remarque : les exigences d’alimentation varient en fonction de l’épaisseur du gel, de la longueur, de la concentration et du type de tampon d’électrophorèse utilisé. Pour cet exercice, nous recommandons d’appliquer une tension constante de 100 V pendant 30 minutes.
4.
Préparer le colorant ADN Fast Blast
a. Pour préparer le colorant 100x (pour la coloration rapide), diluer 100 ml de Fast Blast
500x dans 400 ml d’eau distillée ou déminéralisée dans une fiole ou une bouteille de dimensions appropriées et mélanger. Couvrir la fiole et la stocker à température b. ambiante jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
Pour préparer du colorant 1x (pour coloration dans la nuit), diluer 1 ml de Fast Blast
500x dans 499 ml d’eau distillée ou déminéralisée dans une fiole ou une bouteille de dimensions appropriées et mélanger. Couvrir la fiole et la stocker à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
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Rendre
l’ADN visible
Le colorant ADN Fast Blast est une alternative pratique, sûre et non toxique au bromure d’éthidium pour la détection d’ADN dans les gels d’agarose après l’électrophorèse. Fast Blast contient un produit cationique qui appartient à la famille de colorants thiazole. Les molécules de colorant chargées positivement sont attirées par les groupes de phosphates chargés négativement sur les molécules d’ADN et s'y lient. La formule brevetée de colorant colore l’ADN d'un bleu profond dans les gels d’agarose et donne des résultats vivants, cohérents.
Le colorant ADN Fast Blast est fourni sous la forme d’un concentré 500x qui doit être dilué avant d’être utilisé. Le colorant peut être utilisé en tant que colorant rapide lorsqu'il est dilué à 100x pour permettre la visualisation de l’ADN en 12 à 15 minutes ou être utilisé en tant que colorant sur la nuit lorsqu’il est dilué à 1x. Lorsque le gel d’agarose est plongé dans le colorant ADN Fast Blast, les molécules de colorant s’attachent aux molécules d’ADN piégées dans le gel d’agarose. Lorsque les bandes d’ADN sont visibles, vos élèves peuvent comparer les schémas de restriction d’ADN des différents échantillons d’ADN.
AVERTISSEMENT
Même si le colorant ADN Fast Blast n’est ni toxique ni cancérigène, il est conseillé de porter des gants en latex ou en vinyle lorsque vous manipulez les colorants ou les gels colorés pour éviter de se tacher les mains en bleu. Il est judicieux de porter des blouses de laboratoire ou d’autres vêtements de protection pour ne pas maculer les vêtements. Jeter les solutions de colorant conformément aux protocoles de votre site. Utiliser une solution de blanchiment à
10% ou une solution d’alcool à 70% pour nettoyer Fast Blast de la plupart des surfaces. Avant de les utiliser, vérifier que ces solutions n’endommagent pas la surface.
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Remarques :
• Nous vous recommandons l’utilisation de 120 ml de Fast Blast dilué pour colorer deux gels d’agarose 7 x 7 cm ou 7 x 10 cm dans des cuves de coloration individuelles fournies avec le kit (vous pouvez pratiquer des encoches aux coins du gel pour en faciliter l'identification). Si vous utilisez d’autres cuves de coloration, ajouter un volume suffisant de colorant pour immerger totalement les gels.
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Après l’électrophorèse, les gels d’agarose doivent être retirés des plateaux avant de les placer dans la solution de coloration. Pour ce faire, maintenir la base du plateau d'une main et sortir délicatement le gel en le poussant avec le pouce de l’autre main.
Le gel étant fragile, vous devez faire particulièrement attention lorsque vous le manipulez.
Nous vous recommandons fortement d’utiliser une large spatule ou toute autre surface de support pour transférer le gel d’un conteneur à un autre durant les étapes de décoloration du protocole de coloration rapide.
La décoloration (lorsque l’on suit le protocole de coloration rapide) implique l’utilisation d’au
• moins un conteneur de volume important capable de contenir au moins 500 ml, à chaque poste d’élève. Chaque groupe d’élèves peut utiliser des conteneurs de lavage séparés pour chaque étape de lavage ou simplement utiliser un seul conteneur qui sera vidé après chaque lavage et rerempli pour le lavage suivant.
Fast Blast 100x peut être réutilisé au moins sept fois.
Aucun lavage ou décoloration n’est nécessaire lors de l’utilisation du protocole de coloration pendant toute la nuit.
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