Trousse universelle MiSeqDx 1.0
Retrait des oligonucléotides non liés
Préparation
1 Ramenez le Mélange extension-ligation, le Tampon de lavage rigoureux et le Tampon de lavage universel à température ambiante, puis mélangez brièvement.
2 Assemblez l’unité d’assemblage de la plaque filtrante (ci-après désignée comme FPU) en ordre de haut en bas : couvercle, plaque filtrante, collier d’adaptateur et plaque MIDI.
3 Lavez au préalable la membrane de la plaque filtrante comme suit : a Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage rigoureux à chaque puits.
b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes.
Procédure
1 Retirez la plaque HYB du bloc chauffant et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.
2 Transférez le volume total (environ 55 µl) de chaque échantillon aux puits correspondants de la plaque filtrante.
3 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes.
4 Lavez la plaque filtrante comme suit : a Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage rigoureux à chaque puits d’échantillon.
b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes.
5 Répétez le lavage comme décrit à l’étape précédente.
REMARQUE
Si le tampon de lavage n’est pas complètement évacué, centrifugez encore à 2 400 × g à 20 °C jusqu’à la disparition complète du liquide (5 à 10 minutes supplémentaires).
6 Jetez tout liquide circulant (contenant du formamide), puis réassemblez la FPU.
7 Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage universel à chaque puits d’échantillon.
8 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 10 minutes.
REMARQUE
Veillez à ce que tout liquide soit vidé après la centrifugation. Répétez la centrifugation si nécessaire.
Extension-ligation des oligonucléotides liés
Procédure
1 Ajoutez 45 µl de Mélange extension-ligation à chaque puits d’échantillon de la plaque filtrante.
2 Scellez la plaque filtrante avec une feuille d’aluminium adhésive, puis posez le couvercle.
3 Incubez la plaque FPU dans l’incubateur préchauffé à 37 °C pendant 45 minutes.
Amplification PCR
Préparation
1 Préparez une nouvelle solution 0,05 N NaOH.
2 Déterminez les primers d’index à utiliser selon le graphique de plaque imprimé à partir de Illumina Worklist
Manager.
3 Ramenez le Mélange maître PCR et les primers d’index appropriés à température ambiante. Mélangez chaque tube décongelé, puis centrifugez brièvement les tubes.
4 Préparez une nouvelle plaque PCR à 96 puits (ci-après dénommée la plaque AMP).
5 Ajoutez des primers d’index à la plaque AMP comme suit : a Ajoutez 4 µl des primers d’index sélectionnés [A (A501) – H (A508)] au puits approprié dans une colonne de la plaque AMP.
b Mettez au rebut les bouchons blancs d’origine et utilisez des bouchons blancs neufs.
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Référence 15039608, rév. B FRA
Février 2015
