Trousse universelle MiSeqDx 1.0
c Ajoutez 4 µl des primers d’index sélectionnés [1 (A701) – 12 (A712)] à la rangée appropriée de la plaque
AMP. Les extrémités doivent être changées après chaque rangée pour éviter la contamination croisée de
l’index.
d Mettez au rebut les bouchons orange d’origine et utilisez des bouchons orange neufs.
6 Préparez la solution de travail PCR Mélange maître PCR/Polymérase PCR comme suit : a Pour 96 échantillons, ajoutez 56 µl de Polymérase PCR à 2,8 ml de Mélange maître PCR.
b Retournez 20 fois la solution de travail PCR préparée pour la mélanger.
La solution de travail PCR est stable à température ambiante pendant 10 minutes.
Procédure
1 Retirez le FPU de l’incubateur, puis enlevez l’opercule en aluminium.
2 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 2 minutes.
3 Ajoutez 25 µl de 0,05 N NaOH à chaque puits d’échantillon sur la plaque filtrante. Pipettez la solution NaOH de haut en bas cinq à six fois.
4 Recouvrez et incubez la plaque filtrante à température ambiante pendant 5 minutes.
5 Pendant que la plaque filtrante est en incubation, transférez 22 µl de la solution de travail PCR à chaque puits de la plaque AMP contenant des primers d’index.
6 Transférez les échantillons élués du filtre à la plaque AMP comme suit : a Pipettez les échantillons de la première colonne de la plaque filtrante de haut en bas cinq à six fois.
b Transférez 20 µl de la plaque filtrante à la colonne correspondante de la plaque AMP.
c Pipettez doucement de haut en bas cinq à six fois pour combiner soigneusement l’ADN à la solution de travail PCR.
d Transférez les autres colonnes de la plaque filtrante à la plaque AMP en procédant de la même manière.
Les extrémités doivent être changées après chaque colonne pour éviter la contamination croisée de l’index et de l’échantillon.
7 Scellez la plaque AMP et fixez-la avec un rouleau en caoutchouc.
8 Centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.
9 Transférez la plaque AMP vers la zone de post-amplification.
10 Réalisez la PCR en utilisant le programme suivant sur un thermocycleur :
— 95 °C pendant 3 minutes
— 25 cycles de :
— 95 °C pendant 30 secondes
— 62 °C pendant 30 secondes
— 72 °C pendant 60 secondes
— 72 °C pendant 5 minutes
— Maintenez à 10 °C
POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ
Si vous ne procédez pas immédiatement au nettoyage PCR, la plaque AMP peut rester sur le thermocycleur durant la nuit ou peut être stockée entre 2 °C et 8 °C jusqu’à 48 heures.
Nettoyage PCR
Préparation
1 Ramenez les Billes de nettoyage PCR à température ambiante.
2 Préparez une nouvelle solution d’éthanol à 80 % à partir de l’éthanol absolu.
Procédure
1 Centrifugez la plaque AMP à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.
2 Préparez une nouvelle plaque MIDI (ci-après désignée comme la plaque CLP).
Février 2015
Référence 15039608, rév. B FRA
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