Trousse universelle MiSeqDx 1.0
REMARQUE
En cas de traitement de < 24 échantillons, utilisez un nouveau tube de 1,5 ml.
a Pour 96 échantillons, ajoutez 4,4 ml de Diluant de normalisation de librairie.
b Pipettez les Billes de librairie de haut en bas 10 fois et remettez en suspension.
REMARQUE
Il est extrêmement important de remettre en suspension complètement le culot de billes de la librairie au fond du tube. L’utilisation d’un P1000 permet de s’assurer que les billes sont remises en suspension de manière homogène et qu’il n’y a aucune masse de billes au fond du tube. Cela est essentiel pour atteindre la densité régulière des amplifiats sur la Flow Cell.
c Pour 96 échantillons, pipettez 800 µl de Billes de librairie dans le tube contenant le Diluant de normalisation de librairie.
d Mélangez en retournant le tube 15 à 20 fois.
2 Ajoutez 45 µl de la solution de travail Diluant de normalisation de librairie/Billes de librairie combinée à chaque puits de la plaque LNP contenant des librairies.
3 Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 30 minutes.
4 Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit
évacué.
5 La plaque LNP sur un support magnétique, retirez avec précaution le surnageant et mettez-le au rebut.
6 Retirez la plaque LNP du support magnétique et lavez les billes avec le Lavage de normalisation de librairie comme suit : a Ajoutez 45 µl de Lavage de normalisation de librairie à chaque puits d’échantillon.
b Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 5 minutes.
c Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué.
d Retirez le surnageant et mettez-le au rebut.
7 Répétez la procédure de Lavage de normalisation de librairie comme décrit à l’étape précédente.
8 Utilisez une pipette multicanaux P20 réglée à 20 µl pour retirer tout excès du Lavage de normalisation de librairie.
9 Retirez la plaque LNP du support magnétique et ajoutez 30 µl de la solution 0,1 N NaOH à chaque puits.
10 Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 5 minutes.
11 Pendant l’élution de 5 minutes, préparez une nouvelle plaque PCR à 96 puits (ci-après dénommée la plaque
SGP).
12 Ajoutez 30 µl de Tampon de stockage de librairie à chaque puits à utiliser dans la plaque SGP.
13 Après l’élution de 5 minutes, assurez-vous que tous les échantillons de la plaque LNP sont complètement resuspendus. Si les échantillons ne sont pas complètement remis en suspension, pipettez doucement ces
échantillons de haut en bas ou tapotez doucement la plaque sur la paillasse pour resuspendre les billes, puis secouez pendant encore 5 minutes.
14 Placez la plaque LNP sur le support magnétique pendant au moins 2 minutes.
15 Transférez le surnageant de la plaque LNP à la plaque SGP. Pipettez de haut en bas cinq fois pour mélanger.
16 Scellez la plaque SGP et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.
POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ
Si vous ne procédez pas immédiatement au groupement des librairies et au séquençage ultérieur sur le MiSeqDx, stockez la plaque SGP à une température comprise entre -25 et -15 °C pendant trois jours au maximum.
Groupement de librairies
Préparer le groupement de librairies
1 Réglez sur 96 °C un bloc chauffant adapté aux tubes de centrifugeuse de 1,5 ml.
2 Dans un seau à glace, préparez un bain d’eau glacée. Faites refroidir le Tampon de dilution de librairie dans le bain d’eau glacée.
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3 Commencez à décongeler la cartouche de réactifs du MiSeqDx.
Préparer une nouvelle dilution de NaOH
ATTENTION
L’utilisation de NaOH nouvellement dilué est essentielle pour dénaturer complètement les échantillons pour la génération d’amplifiats sur le MiSeqDx.
1 Combinez les volumes suivants dans un tube de microcentrifugeuse :
— eau sans DNase ni RNase (900 µl)
— stock de 1,0 N NaOH (100 µl)
2 Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger.
Dénaturer et diluer le Contrôle interne PhiX
1 Combinez les volumes suivants pour diluer la librairie Contrôle interne PhiX de 2 nM :
— librairie Contrôle interne PhiX de 10 nM (2 µl)
— Tampon 1X TE (8 µl)
2 Combinez les volumes suivants pour obtenir une librairie Contrôle interne PhiX de 1 nM :
— librairie Contrôle interne PhiX de 2 nM (10 µl)
— 0,1 N de NaOH (10 µl)
3 Mélangez brièvement la solution de la librairie Contrôle interne PhiX de 1 nM.
4 Centrifugez la solution du modèle à 280 × g à 20 °C pendant 1 minute.
5 Incubez à température ambiante durant 4,5 minutes pour dénaturer la librairie Contrôle interne PhiX en brins uniques.
6 Ajoutez le volume suivant de Tampon de dilution de librairie réfrigéré au préalable au tube contenant la librairie de Contrôle interne PhiX dénaturé pour obtenir une librairie Contrôle interne PhiX de 20 pM.
— Librairie Contrôle interne PhiX dénaturée (20 µl)
— Tampon de dilution de librairie préalablement réfrigéré (980 µl)
Préparer la cartouche de réactifs
1 Décongelez la Cartouche de réactifs MiSeqDx dans un bain d’eau contenant assez d’eau déionisée à température ambiante pour submerger la base de la cartouche de réactifs jusqu’à la ligne de délimitation de l’eau imprimée sur la cartouche de réactifs. Le niveau de l’eau ne doit pas dépasser la ligne de délimitation de l’eau maximale.
2 Laissez la cartouche de réactifs décongeler dans le bain dʼeau à température ambiante pendant environ une heure ou jusquʼà décongélation.
3 Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la cartouche. Séchez la base de la cartouche. Assurez-vous que lʼeau n’a pas éclaboussé la partie supérieure de la cartouche de réactifs.
Inspecter la cartouche de réactifs
1 Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez visuellement que toutes les positions sont décongelées.
REMARQUE
Il est essentiel que les réactifs contenus dans la cartouche soient parfaitement décongelés et mélangés afin de garantir un séquençage correct.
2 Inspectez visuellement les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vérifier quʼils sont complètement mélangés et quʼils ne contiennent pas de précipités.
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3 Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair dans les réactifs.
REMARQUE
Les tubes des dispositifs dʼaspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque réservoir pour aspirer les réactifs, il est important quʼaucune bulle dʼair ne reste dans les réservoirs.
4 Placez la cartouche de réactifs sur la glace ou réservez-la à une température comprise entre 2 et 8 °C (jusqu’à
6 heures) jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez directement l’échantillon et configurez lʼanalyse.
Préparer des échantillons pour le séquençage
1 Ramenez le Tampon de dilution de librairie à température ambiante. Mélangez le Tampon de dilution de librairie et assurez-vous que tous les précipités sont complètement dissous.
2 Si la plaque SGP a été conservée congelée, décongelez la plaque SGP à température ambiante.
3 Centrifugez la plaque SGP à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.
4 Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube PAL).
5 Déterminez les échantillons à regrouper pour le séquençage. Un maximum de 48 échantillons peut être regroupé pour le séquençage.
6 Si la plaque SGP a été conservée congelée, mélangez chaque librairie à séquencer en pipettant de haut en bas trois à cinq fois.
7 Transférez 5 µl de chaque librairie à séquencer de la plaque SGP, colonne par colonne, à une barrette de huit tubes PCR. Scellez la plaque SGP avec un joint adhésif de plaque et réservez.
REMARQUE
Après utilisation, conservez la plaque SGP scellée à une température de -25 °C à -15 °C. La plaque SGP scellée est stable pendant un maximum de trois jours.
8 Combinez et transférez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL. Mélangez le tube PAL soigneusement.
9 Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube DAL).
10 Ajoutez 585 µl de Tampon de dilution de librairie au tube DAL.
11 Ajoutez 6 µl de Contrôle interne PhiX de 20 pM au tube DAL. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total.
12 Transférez 9 µl du PAL dans le tube DAL contenant le Tampon de dilution de librairie. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total.
13 Mélangez le tube DAL sous agitateur vortex à vitesse maximale.
14 Centrifugez le tube DAL à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.
15 Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant à 96 °C pendant 2 minutes.
16 Après l’incubation, retournez le tube DAL une à deux fois pour mélanger, puis placez-le immédiatement dans un bain d’eau glacée.
17 Gardez le tube DAL dans un bain d’eau glacée pendant 5 minutes.
Charger des librairies d’échantillons sur la cartouche
1 Utilisez une pointe de pipette séparée, propre et vide de 1 ml pour percer l’opercule en aluminium scellant le réservoir sur la cartouche de réactifs étiquetée Load Samples (Charger les échantillons).
2 Transférez à l’aide de la pipette 600 µl des librairies d’échantillons du DAL dans le réservoir Load Samples
(Charger les échantillons). Prenez soin d’éviter de toucher l’opercule en aluminium lors de la distribution de l’échantillon.
Vérifiez s’il y a des bulles d’air dans le réservoir après le chargement de l’échantillon. Si des bulles d’air sont présentes, tapotez légèrement la cartouche sur la paillasse pour les libérer.
3 Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface MiSeq Operating Software.
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