Trousse universelle MiSeqDx 1.0
Extraction d’ADN
Trois différentes méthodes d’extraction, à savoir l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool et la filtration sur colonne de silice, ont été évaluées à l’aide de sang total K
2
EDTA anticoagulé. Quatorze échantillons de sang unique ont été utilisés dans l’étude, représentant une plage de génotypes d’un seul gène représentatif. Les trois méthodes d’extraction de l’ADN ont été testées indépendamment par deux opérateurs différents qui ont chacun effectué trois analyses par la méthode d’extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents.
La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADNg extrait ont été déterminés par spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168
(14 échantillons × 2 opérateurs/méthode d’extraction × 3 analyses/opérateur × 2 réplicats/échantillon d’ADNg extrait).
Méthode d’extraction
Précipitation dans l’alcool
Filtration sur colonne de silice
Extraction à base de billes magnétiques
Nombre d’échantillons testés
168
168
168
Débit d’appel
100 %
100 %
100 %
Précision
1
100 %
100 %
100 %
Débit au premier passage de l’échantillon
2
100 %
100 %
100 %
1 Précision : la concordance en pour cent avec une méthode d’essai de référence (séquençage bidirectionnel de Sanger) calculée pour les
2 positions de base qui reçoivent une définition des bases.
Débit au premier passage de l’échantillon : le nombre d’échantillons respectant le débit d’appel spécifié la première fois qu’ils sont traités (c’est-à-dire, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une nouvelle analyse ou un traitement supplémentaire) en pourcentage du nombre total d’analyses d’échantillons au cours d’une seule expérience de séquençage MiSeqDx.
Entrée d’ADN
La plage d’entrée d’ADN pour la plateforme MiSeqDx a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série à l’aide de 14 échantillons d’ADN représentatifs contenant 16 variants du gène unique. Chaque échantillon a été testé en double exemplaire sur neuf niveaux d’entrée d’ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng,
25 ng, 10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes de l’échantillon ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel par la méthode de Sanger. Les limites supérieure et inférieure identifiées pour une entrée d’ADN sont respectivement de 1 250 ng et 25 ng, car elles présentaient un débit au premier passage ≥ 95 % sans aucun appel incorrect (précision et débit d’appel de 100 %).
Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont fait l’objet d’autres tests avec quatre échantillons d’ADN représentatifs et 20 réplicats par niveau d’entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 × 20 = 80 échantillons), tandis que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon
(n = 14 × 20 = 280 échantillons). Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision était de 100 % à tous les niveaux d’entrée d’ADN et les débits d’appel de l’échantillon étaient > 99 %.
Substances interférentes
Pour évaluer l’impact des substances interférentes sur la plateforme MiSeqDx, un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases a été évalué en présence et en l’absence d’interférences potentielles. Huit échantillons de sang total représentant huit génotypes uniques ont été utilisés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes
(bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant dans les échantillons de sang total avant l’extraction d’ADN. Pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été intégré dans des échantillons de sang à deux concentrations. Les limites de concentration pour chaque substance sont indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, afin d’évaluer les interférences résultant de la préparation des
échantillons, on a ajouté 15 % de tampon de lavage à huit ADN génomiques purifiés. Un débit d’appel de 100 % a été atteint pour tous les échantillons testés en plus des 100 % de reproductibilité dans les typages génotypiques entre les
échantillons en présence et en l’absence de substances interférentes.
Février 2015
Référence 15039608, rév. B FRA
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