4.C. Étapes de purification (suite)
17. Si l’option de transférer les échantillons dans une plaque ou des tubes finaux a été sélectionnée, un message s’affiche pour demander à l’utilisateur de centrifuger la plaque intermédiaire à 2 500 × g pendant 20 minutes afin d’éliminer les particules résiduelles.
18. La plaque intermédiaire est replacée dans l’appareil, puis les éluats sont transférés aux tubes finaux ou à la plaque finale.
19. La méthode est terminée.
5. Résultats du développement
Les données décrites ci-dessous sont représentatives de plusieurs groupes de données obtenues au cours du développement. Le traitement de tous les échantillons présentés a été démarré dans des tubes de 50 ml. Les éluats obtenus ont été laissés sur la plaque intermédiaire pour l’analyse.
5.A. Rendement de la purification automatisée
La quantité d’ADN obtenue avec le système de purification automatisé de l’ADN ReliaPrep™ présente un rapport linéaire avec le volume initial de l’échantillon, tout au long de la plage recommandée de volume de départ. Les
échantillons présentés à la Figure 1 proviennent d’un seul donneur. Chaque échantillon a été traité à l’aide du système automatisé ReliaPrep™.
300
250
200
150
100
50
0
0 2
1.0
4 6
Rendement moyen (µg)
Rapport 260/280 moyen
Rapport 260/230 moyen
8
Volume initial de sang (ml)
10 12
0.5
0
2.0
1.5
Figure 1. Rendement en ADN par la procédure automatisée en fonction du volume de départ. Les
échantillons de couches leucocytaires ont été préparés à partir d’un seul donneur. Chaque point est la moyenne de quatre réplicats et les barres d’erreur représentant un écart-type. Rendements en ADN déterminé à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop
®
.
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5.B. Contrôle de contamination croisée
Ce système intégré utilise une série d’étapes de nettoyage pour faire en sorte que les constituants entrant en contact avec les échantillons et partagés entre ceux-ci ne présentent pas de risque de contamination croisée. Pour une description détaillée des méthodes utilisées pour vérifier l’intégrité des échantillons sur l’appareil Tecan
Freedom EVO
®
-HSM Workstation, veuillez vous reporter à la note d’application Verification of Sample Integrity
for the Tecan Freedom EVO
®
-HSM Workstation, n o
AN204, à l’adresse www.promega.com.
6. Dépannage
Pour toute question qui ne serait pas traitée ci-dessous, veuillez consulter une succursale ou un distributeur
Promega local. Les coordonnées de ceux-ci sont disponibles au site : www.promega.com. Adresse électronique :
techserv@promega.com.
Symptômes
Faible rendement en ADN
Causes possibles et commentaires
La résine ReliaPrep™ n’a pas été remise en suspension de façon adéquate avant l’emploi. Resuspendez la résine ReliaPrep™ avec soin dans le flacon de réactif avant de la transférer pour la purification des échantillons.
L’échantillon contenait trop peu de leucocytes. Le rendement en
ADN dépend de la quantité de matériel de départ. Les échantillons avec un faible taux en leucocytes ou les couches leucocytaires où seule une partie des leucocytes a été récupérée présenteront un moindre rendement en raison de la quantité réduite au départ.
Le volume initial de l’échantillon dépasse la capacité de traitement du système. Le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA Isolation
System a été optimisé pour purifier de l’ADN d’échantillons de couches leucocytaires préparés à partir de 2,5 à 10 ml de sang total.
Le traitement d’échantillons de sang en dehors de cette plage recommandée peut entraîner une réduction du rendement en ADN et de sa concentration. Le ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA
Isolation System a été optimisé pour des échantillons de sang normaux provenant d’adultes en bonne santé, qui contiennent en général entre 4,5 × 10
6
et 1 × 10
7
leucocytes/ml.
L’utilisation réussie du ReliaPrep™ Large Volume HT gDNA
Isolation System dépend de l’usage des réactifs appropriés dans l’ordre voulu. Vérifiez si tous les réactifs ont bien été placés dans la position adéquate de l’appareil et s’ils ont été dilués correctement avant l’emploi.
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6. Dépannage (suite)
Symptômes
ADN dégradé
Résine ReliaPrep™ dans l’éluat final
Médiocre pureté de l’ADN
Message d’erreur de l’appareil
Causes possibles et commentaires
Des nucléases ont été introduites au cours de la purification ou du maniement. Utilisez des récipients en plastique ou en verre sans nucléases. Utilisez des cônes à filtre pour toutes les étapes de pipetage. Portez des gants à tout moment. Les nucléases
éventuellement introduites après l’élution dégradent l’ADN. Pour protéger l’ADN élué contre les nucléases, sélectionnez l’option d’ajouter du tampon TE concentré à une concentration de 1X dans l’éluat final.
L’ADN était dégradé avant la procédure de purification. Si l’ADN
était dégradé avant la purification, l’ADN résultant le sera également.
Les solutions concentrées d’ADN peuvent être visqueuses. Il peut
être nécessaire de prolonger le temps de capture de la résine
ReliaPrep™ pour ces solutions visqueuses. Éliminez la résine résiduelle de l’ADN élué en effectuant la centrifugation comme indiqué.
Une médiocre pureté de l’ADN, observée par les rapports spectroscopiques ou dans les analyses en aval, est souvent le résultat d’un retrait incomplet du lysat. Tout ajustement physique du système robotique peut influencer l’efficacité du retrait du lysat.
Contactez le service technique à l’adresse
techserv@promega.com avant de tenter d’ajuster le système robotique.
Si le système signale un volume insuffisant dans un bac de réactif, vérifiez que le type de bac utilisé est adéquat et ajoutez du réactif au bac.
Si vous observez d’autres erreurs, contactez le service technique de Promega. Notez le message d’erreur précis et l’heure. Vous aurez besoin des fichiers de rapport détaillés EVOware ® , enregistrés sous : C:\ProgramData\Tecan\EVOware\AuditTrail\log.
Les fichiers de rapport utilisent la convention de dénomination suivante : EVO_aaaammjj_hhmmss.log (la date et l’heure correspondent à la création du fichier).
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7. Produits associés
PRODUIT
Appareil HSM 2.0
Solution de RNase A
Solution tampon TE 20X (pH 7,5)
Tecan Freedom EVO
®
-HSM Workstation
Protéase alcaline (Alkaline Protease, APA)
Tampon de lyse cellulaire (Cell Lysis Buffer, CLD)
Tampon de liaison (Binding Buffer, BBA)
Résine ReliaPrep™
Tampon de lavage (Wash Buffer, WBA)
Solution de protéinase K (PK)
Eau sans nucléase
Tampon de lyse tissulaire (Tissue Lysis Buffer, TLA)
Bouteille pour éthanol à 50 %
CONDITIONNEMENT RÉF.
1 pièce A2715
5 ml
25 ml
A7974
A2651
130 ml
1 400 ml
1 600 ml
Contacter Promega
A1721
A1731
A1741
115 ml
130 ml
23 ml
500 ml
1 000 ml
500 ml
1 pièce
A1752
A2681
A5051
P1197
P1199
A5091
A2691
© 2013, Promega Corporation. Tous droits réservés.
QuantiFluor et ReliaPrep sont des marques de commerce de Promega Corporation.
TouchTools est une marque déposée de Tecan AG Corporation. EVOware et Freedom EVO sont des marques déposées de
Tecan AG Corporation. NanoDrop est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.
Tous les prix et toutes les caractéristiques sont sujets à modification sans avis préalable.
Les déclarations relatives aux produits sont sujettes à modification. Veuillez contacter le service technique de Promega ou consulter le catalogue en ligne de Promega pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits Promega.
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