cytiva ™ RNA delivery LNP kit Mode d'emploi

Cytiva™ RNA delivery LNP kit
Mode d’emploi
Traduit de l’anglais
Introduction
À lire avant de déballer ou d’utiliser le
kit
Ces instructions contiennent des informations importantes pour la manipulation, le
déballage et la préparation en toute sécurité du kit Cytiva™ RNA delivery LNP kit, 3 ml et
6 ml.
Avant d’utiliser ce produit, tous les utilisateurs doivent lire le présent document ainsi que
le Mode d’emploi des instruments NanoAssemblr™ Ignite™ et Ignite+™.
Utilisation prévue
Le kit Cytiva RNA delivery LNP kit est uniquement destiné à la recherche relative aux
vaccins à ARN.
Il s'agit d'un produit autonome et doit être uniquement utilisé avec l’instrument Ignite ou
Ignite+ et les cartouches NxGen™Ignite.
Ce produit est uniquement destiné à la recherche et ne doit pas être utilisé dans le cadre
de procédures cliniques ou in vitro, ou à des fins diagnostiques ou thérapeutiques.
Sécurité
Pour une utilisation et une manipulation des produits en toute sécurité, se reporter à la
fiche de données de sécurité (FDS) de chaque produit chimique utilisé dans la procédure.
Scanner le code QR figurant sur l’emballage pour accéder à la FDS des composants.
cytiva.com
29798795 AA
Généralités
Description
Le kit Cytiva RNA delivery LNP est un mélange de réactifs à base de nanoparticules lipidiques (NPL), qui est optimisé pour l'administration d’ARN dans des essais précliniques de
vaccins utilisant des modèles de petits rongeurs. Il est disponible en deux volumes : 3 ml
et 6 ml. Le kit Cytiva RNA delivery LNP inclut un mélange de lipides ionisables et tous les
réactifs nécessaires pour préparer les NPL sur l'instrument NanoAssemblr Ignite ou
Ignite+.
Applications typiques
• Administration in vivo d’ARNm et de pARNa au cours d’essais précliniques de vaccins
• Analyse in vitro de la charge d’ARN
Ressources en ligne pour l’utilisateur
L’utilisateur peut télécharger les ressources sur les produits suivants depuis Internet.
• Cytiva RNA delivery LNP kit Workbook
• RiboGreen Assay Protocol to Determine RNA Encapsulation Efficiency
Pour obtenir les fichiers des documents, effectuer une recherche par titre de document
sur le site cytiva.com.
Documentation de l’utilisateur
La documentation de l’utilisateur est répertoriée dans le tableau ci-dessous.
Documentation
Contenu principal
Mode d'emploi des instruments
NanoAssemblr Ignite et Ignite+
(NIN1134)
Instructions nécessaires à la préparation et à
l’exploitation correcte et en toute sécurité de
l’instrument Ignite ou Ignite+
Dans le présent document, ce
document est appelé Mode
d’emploi de l'instrument.
Vue d’ensemble du système, exigences relatives
au site et instructions relatives au déplacement
du système à l’intérieur d’un bâtiment
Instructions pour la maintenance et le dépannage de base
2
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Accès à la documentation utilisateur en
ligne
Scanner le code QR ou visiter le site cytiva.com/instructions. Saisir le titre ou le numéro
de document pour accéder au fichier.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
3
Composants du kit
Composants et stockage
Le tableau suivant indique les noms des composants et les températures de stockage
pour tous les composants du kit.
Étiquette
Contenu
Taille
Stockage
Lipid mix
Mélange de lipides
3 ml
-80 °C
6 ml
Formulation buffer
Tampon de formulation
6 ml
2 °C à 8 °C
Tampon de dilution
100 ml
2 °C à 8 °C
Tampon de cryoconservation
12 ml
-80 °C
type 1
Dilution buffer
type 1 10X
Cryopreservation buffer
type 1
Remarque :
Tous les éléments du kit sont expédiés dans de la glace sèche et
peuvent arriver sur site congelés. Avant de les utiliser, s'assurer
que les tampons sont entièrement décongelés et qu'ils ont été
resolubilisés à l’aide d’un agitateur vortex pendant 30 secondes.
Date d’expiration
Voir les différents éléments.
Capacité du kit
Pour un rapport N/P1 de 8, les kits permettent la formulation des quantités d’ARN
suivantes :
Kit
Volume de formulation
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml
~0,7 mg d’ARN
Cytiva RNA delivery LNP kit, 6 ml
~1,5 mg d’ARN
Quand un volume total de 2 ml de NPL est préparé avec un rapport de débit (FRR) de 3:1
et un rapport N/P de 8, la récupération d’ARN prévue dans l'échantillon final est de
70 % à 80 %.
1
4
Le rapport N/P correspond au rapport molaire des amines (azote) dans les groupes ionisables lipidesphosphates de l'acide nucléique.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Si le rapport N/P pour la formulation des NPL est inférieur, la récupération d’ARN est
proportionnellement supérieure.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
5
Matériel requis
Matériel requis fourni par Cytiva
• Instrument NanoAssemblr Ignite ou Ignite+
• Cartouches NanoAssemblr Ignite ou Ignite+
Voir la section Recherche des informations de commande sur Internet, à la page 22
pour plus d’informations.
Matériel requis fourni par l’utilisateur
Le matériel suivant est nécessaire pour préparer les NPL-ARN avec le présent kit. Tous
les consommables en plastique utilisés pendant la préparation, la formulation et le stockage des NPL doivent être stériles et sans RNase, selon le cas.
• Lecteur de plaques en fluorescence
• Bloc chauffant ou étuve capable de chauffer à 55 °C
• Spectromètre UV
• Agitateur vortex
• Centrifugeuse réfrigérée avec rotor oscillant
• Tubes de centrifugation coniques : 15 ml et 50 ml
• Tubes de 0,5 à 2 ml avec capuchon à vis et joint torique
• Seringue jetable : 1 ml, 3 ml, 5 ml ou 10 ml
Remarque :
Voir le Mode d'emploi de l'instrument pour connaître les
marques et les tailles de seringue à utiliser en fonction des
paramètres de formulation. Il est recommandé d’utiliser la
plus petite taille de seringue possible pouvant recueillir le
volume requis.
• Micropipettes et cônes de pipette
• Pipeteur et pipettes sérologiques
• Aiguilles émoussées
• Filtres de seringue stériles : 13 mm, 0,2 µm, polyéthersulfone (PES)
• Filtres de centrifugation Amicon® à seuil de coupure (MWCO) de 30 kDa, 15 ml
• Plaques à 96 puits à fond noir, surface non traitée
• Quant-iT RiboGreen Assay Kit
• Triton X-100
• Eau de qualité biologie moléculaire
• Isopropanol à 70 %
6
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
• Solution de décontamination des RNases
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
7
Vue d’ensemble du flux de travail
Cette section décrit le flux de travail de préparation des NPL-ARN sur les instruments
Ignite et Ignite+, y compris la préparation de la solution d’ARN, la manipulation de l’instrument et la préparation des NPL. Le tableau ci-dessous présente un flux de travail type
utilisant un kit Cytiva RNA delivery LNP kit.
Étape
Action
Description
1
Remplissage de la
feuille de calcul Cytiva
RNA delivery LNP
Workbook
Calcul de la consommation en réactifs et préparation du matériel
2
Préparation de l’espace
de travail et des réactifs
Décongélation et préparation des réactifs, qui
doivent avoir les concentrations requises
3
Préparation de la solution d’ARN
Préparation de la solution d’ARN en combinant
la charge d’ARN avec le tampon de formulation
et l’eau de qualité biologie moléculaire inclus
4
Formulation de NPLARN
Formulation des NPL sur l’instrument
5
Traitement en aval des
NPL
• Échange de tampon et concentration des
NPL à l'aide de filtres de centrifugation
• Ajout du tampon de cryoconservation
• Filtration stérile
6
Détermination des
caractéristiques physicochimiques des NPL
• Détermination de la taille et de la polydispersité des NPL par diffusion dynamique de la
lumière (DLS) ou toute autre méthode équivalente
• Quantification de l’ARN encapsulé en s’appuyant sur l’essai RiboGreen
7
8
Dilution pour atteindre
la concentration voulue
Dilution des NPL-ARN à la concentration voulue
en fonction de la concentration de l’ARN encapsulé
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Remplissage de la feuille de calcul
L'outil Cytiva RNA delivery LNP kit Workbook permet de calculer les paramètres et les
volumes pour la formulation des NPL sur les instruments Ignite et Ignite+.
L'outil Cytiva RNA delivery LNP kit Workbook est également appelé Feuille de calcul dans
le présent document. Cette Feuille de calcul est disponible sur Internet. Voir la section
Ressources en ligne pour l’utilisateur, à la page 2.
Dans Step 1: User Input (Étape 1 : saisie de l'utilisateur), l’utilisateur doit saisir les
valeurs des paramètres indiqués dans le tableau ci-dessous. Des valeurs recommandées
sont également mentionnées pour les paramètres concernés.
Paramètre
Description
Valeur recommandée
Total flow rate
(mL/min)
Sommes des débits des
canaux C et R avant la dilution
en ligne facultative
20 ml/min
Total LNP volume
(mL)
Volume total de NPL préparé, y
compris les déchets
Déterminé par l’utilisateur
Remarque :
Cette valeur n’inclut pas le
volume ajouté par la dilution en
ligne.
RNA stock
concentration
(mg/mL)
Concentration de la solution
mère d’ARN
Mesurée par UV-vis
Lipid mix working
concentration
(ratio of stock
concentration)
Concentration du mélange de
lipides utilisé pendant la procédure par rapport au mélange
de lipides fourni dans le kit
1
In-line dilution
ratio Dil:LNP
(X:1)
Ratio de dilution diluant:NPL, si
une dilution en ligne est effectuée
2
Flow rate ratio
Aq:Lipid (X:1)
Ratio des volumes des liquides
des seringues C et R
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Remarque :
Laisser vide ou saisir
N/A si ce paramètre
est sans objet.
3
9
Paramètre
Description
Valeur recommandée
N/P ratio
Rapport molaire des amines
(azote) dans les groupes ionisables lipides-phosphates de
l'acide nucléique
8
Lipid mix excess
(mL)
Volume de mélange de lipides
préparé en plus du volume
nécessaire pour compenser les
pertes lors des transferts
Déterminé par l’utilisateur
RNA solution
excess (mL)
Volume de solution d’ARN
préparé en plus du volume
nécessaire pour compenser les
pertes lors des transferts
Déterminé par l’utilisateur
Start waste (mL)
Volume de liquide devant être
récupéré dans le tube de récupération des déchets au début
du cycle
Voir le Mode d'emploi de l'instrument
pour connaître les
volumes de déchets
recommandés en
fonction des tailles
de seringue utilisées.
End waste (mL)
Volume de liquide devant être
récupéré dans le tube de récupération des déchets à la fin du
cycle
Voir le Mode d'emploi de l'instrument
pour connaître les
volumes de déchets
recommandés en
fonction des tailles
de seringue utilisées.
Remarque :
Pour des structures d’ARN plus complexes et de plus grande
taille, il est recommandé d’utiliser les paramètres de formulation
et de procédé suivants pour produire des NPL de plus petite taille,
avec un indice de polydispersité (PDI) plus faible et une meilleure
encapsulation de l’ARN :
• rapport N/P de 8,
• rapport de débit (FRR) de 5,
• concentration du mélange de lipides de 0,5X.
10
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Préparation de l’espace de travail et des réactifs
Suivre les étapes ci-dessous pour préparer l’espace de travail et les réactifs. Pour maintenir les réactifs stériles, réaliser toutes les étapes à l’intérieur de l'armoire de biosécurité (ESB) et utiliser du matériel de laboratoire stérile en plastique.
Étape
Action
1
Mettre l’ESB en marche et la nettoyer avec une solution de décontamination
des RNases puis de l’isopropanol à 70 %.
2
Décongeler le tube de lipides à 55 °C pendant 5 minutes dans un bain à billes
ou un bloc chauffant. Maintenir le tube fermé pour éviter toute évaporation
quand la température du mélange de lipides est supérieure à la température
ambiante.
3
Une fois le mélange de lipides décongelé, transférer le tube sur un agitateur
vortex à température ambiante.
Remarque :
Après la décongélation du mélange de lipides, il est recommandé de le
répartir, en parts aliquotes, dans des récipients de plus petit volume. Cela
permet de maintenir le mélange de lipides stérile et de réduire le nombre de
cycles de congélation-décongélation.
4
Placer les éléments suivants dans l’ESB.
• Les composants du kit : mélange de lipides, tampon de formulation,
tampon de dilution, tampon de cryoconservation
• Eau de qualité biologie moléculaire
• Tubes stériles d’un volume adéquat pour la préparation des solutions à la
concentration requise :
- Tampon de dilution
- Tampon de cryoconservation 2X
- Tampon de cryoconservation 1X
- Solution d’ARN
- Mélange de lipides
• Tubes stériles étiquetés pour les échantillons suivants :
- Échantillon concentré : un tube de collecte pour l’échantillon de NPLARN, avant la filtration stérile
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
11
Étape
Action
- Échantillon de cryoconservation : un tube de collecte pour diluer
l’échantillon de NPL-ARN avec le tampon de cryoconservation avant la
filtration stérile
- Échantillon stérile : un tube de collecte pour l’échantillon de NPL-ARN
final après la filtration stérile
- Échantillon à analyser : un tube de collecte pour la répartition en parts
aliquotes d’un petit volume de NPL en vue d’une diffusion dynamique de
la lumière (DLS) et d’un essai RiboGreen
Remarque :
Le volume et le nombre de chaque type de tube dépend des paramètres de
formulation.
• Micropipettes de 20 μl, 200 μl et 1 ml et cônes de pipette sans RNase
• Pipettes sérologiques sans RNase (du volume requis et dans la quantité
nécessaire) et pipeteur
• Seringues, aiguilles et filtres de 0,2 µm
• Éthanol, si nécessaire
5
Préparer le tampon de dilution 1X dans un tube stérile :
a. Saisir le volume final de tampon de dilution 1X requis dans l’étape 2 de la
Feuille de calcul.
b. Diluer le tampon de dilution 10X fourni dans le kit avec de l’eau de qualité
biologie moléculaire en respectant les volumes indiqués à l’étape 2.
6
Préparer le tampon de cryoconservation 2X dans un tube stérile :
a. Saisir le volume final de tampon de cryoconservation 2X requis dans
l’étape 3 de la Feuille de calcul.
12
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Étape
Action
b. Diluer le tampon de cryoconservation 5X fourni dans le kit avec de l’eau de
qualité biologie moléculaire en respectant les volumes indiqués à
l’étape 3.
7
Préparer le tampon de cryoconservation 1X dans un tube stérile :
a. Saisir le volume final de tampon de cryoconservation 1X requis dans
l’étape 4 de la Feuille de calcul.
b. Diluer le tampon de cryoconservation 5X fourni dans le kit avec de l’eau de
qualité biologie moléculaire en respectant les volumes indiqués à
l’étape 4.
Astuce :
Pour un calcul précis du volume, patienter et effectuer cette opération à
l'étape précédant le début de la procédure de dilution décrite à la section Dilution à la concentration voulue, à la page 21.
8
Préparer le mélange de lipides comme suit :
a. Veiller à ce que le mélange de lipides refroidisse à température ambiante.
b. Mélanger le contenu du tube avec un agitateur vortex pour s'assurer que
le mélange des lipides est homogène.
c. Ajouter le volume requis de mélange de lipides (1) dans un tube stérile
d’une taille adaptée, comme indiqué à l’étape 5 de la Feuille de calcul. Si
une dilution doit être exécutée, ajouter le volume d’éthanol (2) dans le tube
et mélanger minutieusement par pipetage.
1
2
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
13
Préparation de la solution d’ARN
Pour la manipulation de solutions d’ARN, toujours suivre les recommandations cidessous :
• Décongeler les solutions mères d’ARN et les conserver sur de la glace.
• Toujours ouvrir les solutions mères d’ARN dans l’ESB.
• Répartir les solutions mères d’ARN en parts aliquotes dans différents récipients pour
ne pas avoir à réaliser plusieurs cycles de décongélation-congélation.
• Ne pas agiter les solutions d’ARN avec un agitateur vortex.
• Avant utilisation, les mélanger délicatement par inversion et pipetage.
• Utiliser des cônes de pipette sans RNase pour mesurer et transférer les solutions
d’ARN.
Suivre les étapes ci-dessous pour préparer la solution d’ARN. Pour maintenir l’état stérile
des réactifs, effectuer toutes les étapes utilisant des tubes ouverts à l'intérieur de l’ESB.
14
Étape
Action
1
Récupérer une part aliquote d’ARN congelée, puis la décongeler sur de la
glace. Toujours conserver l’ARN sur de la glace afin d’empêcher sa dégradation.
2
Une fois décongelée, mesurer la concentration de la solution mère d’ARN par
UV-Vis.
3
Saisir la concentration mesurée de la solution mère d’ARN dans l’étape 1 de la
Feuille de calcul.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Étape
Action
4
À l'aide d'une pipette, prélever les volumes de tampon de formulation (1) et
d’eau de qualité biologie moléculaire (2) (indiqués à l’étape 6 de la Feuille de
calcul) dans un tube destiné à la solution d’ARN.
1
2
3
5
Ajouter le volume requis d’ARN (3) dans le tube de solution d’ARN, comme
indiqué à l’étape 6 de la Feuille de calcul.
6
Prélever l'échantillon avec précaution à l'aide d'une pipette, le verser, puis
mélanger.
Conserver la solution mère d’ARN sur de la glace jusqu’à utilisation.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
15
Formulation de NPL-ARN
Suivre les étapes ci-dessous pour formuler les NPL-ARN sur l’instrument Ignite ou Ignite
+.
Étape
Action
1
Mettre l’instrument en marche comme décrit dans le Mode d’emploi.
2
Nettoyer l’instrument avec une solution de décontamination des RNases puis
avec de l’isopropanol à 70 %.
3
Dans le menu principal, appuyer sur Quick Run (Cycle rapide).
4
Sélectionner les seringues à utiliser pour les solutions L, C et R en se basant
sur les volumes calculés nécessaires pour chaque solution, indiqués en gris à
l’étape 7 dans la Feuille de calcul.
Remarque :
Il est recommandé d’utiliser la plus petite taille de seringue pouvant recueillir
les volumes calculés.
5
Sur l’interface utilisateur de l’instrument, saisir les paramètres du cycle indiqués dans les cellules oranges de l’étape 7 de la Feuille de calcul. Voir le Mode
d’emploi de l’instrument pour plus de détails.
6
Insérer la cartouche dans l’instrument.
7
Préparer la seringue R avec le mélange de lipides :
a. Agiter la solution de mélange de lipides à l'aide d’un agitateur vortex.
16
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Étape
Action
b. Aspirer la quantité de mélange de lipides requise dans la seringue en utilisant une aiguille émoussée propre.
Remarque :
Il est recommandé de prélever 100 à 200 µl de mélange supplémentaires
dans les seringues pour garantir que le volume complet est administré
dans la cartouche.
Astuce :
Pour éviter les bulles d’air, suivre les étapes décrites ci-dessous.
i.
Aspirer 0,2 à 0,3 ml dans la seringue, hors aiguille.
ii.
Éliminer les éventuelles bulles d'air près du joint d’étanchéité en
caoutchouc en tapotant sur la seringue.
iii.
Avec précaution, évacuer l'air présent dans la seringue jusqu’à ce
qu'une goutte apparaisse au bout de l'aiguille.
iv.
Aspirer le reste de solution dans la seringue, hors aiguille.
c. Retirer l’aiguille de la seringue.
d. À l’aide du piston, pousser le liquide dans la seringue en évitant tout écoulement au niveau de la pointe de la seringue.
e. Vérifier que le volume requis plus un faible volume supplémentaire sont
présents dans la seringue R.
8
À partir du tube de solution d’ARN, aspirer la totalité de la solution dans la
seringue C en suivant la procédure décrite ci-dessus pour la seringue R.
Remarque :
Ne pas agiter la solution d’ARN sur un agitateur vortex, mais utiliser plutôt une
pipette pour aspirer/verser la solution avec précaution afin de la mélanger.
9
Si la procédure inclut une dilution en ligne, prélever le tampon de dilution 1X
dans la seringue L en suivant la procédure décrite ci-dessus pour la
seringue R.
10
Poursuivre et fixer les seringues R, C et L (si nécessaire), puis commencer la
procédure de formulation sur l’instrument comme indiqué dans le Mode d’emploi de ce dernier.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
17
Traitement en aval des NPL
Suivre les étapes ci-dessous après avoir terminé l’étape de formulation sur l’instrument.
Étape
Action
1
Diluer les NPL-ARN avec le volume de tampon de dilution 1X de l'étape 8 de la
Feuille de calcul, afin d’obtenir une dilution totale par 10.
Remarque :
Par exemple, si une dilution en ligne de 2:1 a été effectuée (dilution en ligne
par 3), la feuille de calcul calcule le volume de sorte qu'une dilution manuelle
par 3,33 avec le tampon de dilution 1X soit ensuite effectuée.
2
Conserver les NPL-ARN diluées sur de la glace jusqu’à la filtration centrifuge.
3
Remplir les filtres pour centrifugation de NPL-ARN diluées.
4
Centrifuger à 2000 x g pendant 20 minutes à 4 °C dans un rotor à godets oscillants.
Remarque :
L’utilisation de vitesses plus élevées permet de réduire le temps de traitement.
Toutefois, les structures d’ARN plus longues et plus complexes doivent être
manipulées avec précaution. La vitesse maximale recommandée est de
4000 x g.
18
5
Jeter la solution se trouvant en dessous de l’unité de filtration et répéter
l’étape 3 et l’étape 4 si nécessaire, jusqu’à ce que la totalité de l’échantillon
soit reconcentrée et atteigne approximativement le volume de NPL-ARN de
départ.
6
Effectuer une dilution par 5 avec le tampon de dilution 1X dans le filtre de
centrifugation et reconcentrer l'échantillon jusqu’à atteindre le volume de
NPL-ARN de départ.
7
Jeter la solution se trouvant en dessous de l'unité de filtration.
8
Répéter l’étape 6 et l’étape 7 . Lors de la reconcentration, viser un volume
équivalant à la moitié du volume de NPL-ARN souhaité.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Étape
Action
9
Récupérer l'échantillon dans le filtre à l'aide d’une micropipette, puis le transférer dans le tube de l’échantillon concentré .
Remarque :
Il est recommandé de placer la pipette sur la membrane pour une meilleure
récupération de l'échantillon.
10
Facultatif : laver la membrane du filtre avec environ 100 à 200 µl de tampon de
dilution 1X pour augmenter la récupération des NPL-ARN.
11
Mesurer le volume de NPL-ARN récupéré du filtre pour centrifugation, y
compris le volume de lavage. Saisir cette valeur à l’étape 8 de la Feuille de
calcul (1).
1
2
La feuille de calcul calcule la concentration théorique de l'échantillon de NPLARN final après la dilution avec le tampon de cryoconservation et la filtration
stérile (2).
12
Prélever avec une pipette des volumes identiques d’échantillon et de tampon
de cryoconservation 2X, et les verser dans le tube de tampon de cryoconservation.
13
Avec la pipette, aspirer/verser l'échantillon au moins cinq fois afin de
mélanger les NPL et le tampon.
14
Dans l’ESB, filtrer l'échantillon de cryoconservation en plaçant un filtre stérile
de 0,2 µm dans le tube stérile de l’échantillon stérile.
Astuce :
Pour maximiser la récupération des NPL, introduire de l’air dans le filtre à deux
ou trois reprises pour garantir la collecte de tous les résidus de NPL.
15
Prélever une part aliquote de NPL-ARN pour obtenir le volume requis et la
verser dans le tube d’échantillon à analyser.
16
Stocker le tube d’échantillon stérile dans un environnement réfrigéré en
attendant les résultats de l'analyse physicochimique.
17
Mesurer la taille des particules par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Si
nécessaire, contacter Cytiva pour obtenir un protocole de mesure détaillé.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
19
20
Étape
Action
18
Déterminer la concentration en ARN des NPL à l’aide de l’essai RiboGreen.
Voir le document RiboGreen Assay Protocol to Determine RNA Encapsulation
Efficiency, disponible sur Internet, pour obtenir des instructions détaillées.
Voir la section Ressources en ligne pour l’utilisateur, à la page 2.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Dilution à la concentration voulue
Exécuter les étapes suivantes dans l’ESB pour maintenir le ou les échantillons de NPLARN stériles.
Étape
Action
1
Diluer les NPL-ARN à la concentration voulue avec le tampon de cryoconservation 1X.
Remarque :
S'appuyer sur les résultats de l’essai RiboGreen pour déterminer les volumes
nécessaires pour atteindre cette concentration.
2
Pour mélanger minutieusement ces volumes, les aspirer/verser à l'aide d’une
pipette à cinq reprises minimum.
3
Répartir l'échantillon en parts aliquotes dans plusieurs tubes pour limiter le
nombre de cycles de congélation-décongélation des NPL-ARN.
Remarque :
Il est recommandé de soumettre les NPL-ARN à un cycle de congélationdécongélation maximum.
Les NPL-ARN sont désormais prêtes à être utilisées. Pour un stockage de courte durée,
conserver l’échantillon à 4 °C et l’utiliser dans un délai d’une (1) semaine maximum. Pour
un stockage de longue durée (9 mois maximum), conserver les échantillons à -80 °C.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
21
Recherche des informations de commande sur
Internet
Les informations les plus récentes sur les produits proposés et les codes des produits
sont disponibles sur Internet. Suivre les étapes ci-dessous pour rechercher des systèmes
de formulation de nanoparticules lipidiques, des réactifs, des cartouches ou d’autres
accessoires.
22
Étape
Action
1
Accéder au site cytiva.com.
2
Effectuer une recherche par nom de produit ou catégorie de produit.
3
Naviguer jusqu'à la page du produit recherché.
4
Faire défiler jusqu’à la section Product Specifications (Caractéristiques des
produits), qui indique les noms des produits, les codes des produits et d’autres
informations de commande.
Cytiva RNA delivery LNP kit, 3 ml et 6 ml Mode d’emploi 29798795 AA
Page laissée intentionnellement vide
cytiva.com
Cytiva et le logo Drop sont des marques de commercede Life Sciences IP Holdings Corporation ou de l'une de ses
sociétés affiliées opérant sous le nom de Cytiva.
Ignite, Ignite+, NanoAssemblr et NxGen sont des marques de commerce de Global Life Sciences Solutions USA LLC
ou de l’une de ses sociétés affiliées opérant sous le nom de Cytiva..
Amicon est une marque de commerce de Merck KGaA. Triton est une marque de commerce de Union Carbide
Corporation. RiboGreen et Quant-iT sont des marques de commerce de Thermo Fisher Scientific.
Toute autre marque de commerce tierce est la propriété de son détenteur respectif.
© 2024 Cytiva
Pour les coordonnées des bureaux locaux, visiter le site cytiva.com/contact
29798795 AA V:3 07/2024
">