Instrument MiSeqDx
Configuration de l’analyse
1 Connectez-vous au Logiciel d’exploitation de MiSeq (MOS).
2 Sélectionnez Sequence (Séquence).
Une série d’écrans de configuration de l’analyse s’affiche dans l’ordre suivant : Load Flow Cell (Charger la
Flow Cell), Load Reagents (Charger les réactifs), Review (Révision) et Pre-Run Check (Vérification avant analyse).
3 Lorsque l’écran Load Flow Cell (Charger la Flow Cell) s’affiche, nettoyez et chargez la Flow Cell.
4 Fermez le verrou de la Flow Cell et la porte du compartiment de la Flow Cell.
Le verrou et la porte du compartiment doivent être fermés avant le lancement de l’analyse. Une fois la Flow
Cell chargée, le logiciel lit et enregistre lʼidentification par radiofréquence (RFID). Une confirmation de lecture
RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran.
5 Lorsque l’écran Load Reagents (Charger les réactifs) s’affiche, videz le flacon à déchets, chargez le flacon de
Solution SBS (PR2) MiSeqDx, puis chargez la cartouche de réactifs.
Lorsque le flacon de MiSeqDx SBS Solution (PR2) et la cartouche de réactifs sont chargés, le logiciel lit et enregistre le RFID. Une confirmation de lecture RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran.
6 Sélectionnez la feuille d’échantillons appropriée.
Par défaut, le logiciel recherchera un fichier de feuille dʼéchantillons avec un nom correspondant au code à barres de la cartouche de réactifs chargée sur lʼinstrument.
7 Confirmez les paramètres d’analyse et les résultats de la vérification avant analyse.
8 Démarrez l’analyse.
Lʼécran Sequencing (Séquençage) sʼouvre lorsque lʼanalyse démarre. Cet écran fournit une représentation visuelle de lʼanalyse en cours, y compris les intensités et les scores de qualité.
Résultats
Le logiciel d’analyse primaire intégré (analyse temps réel ou RTA) exécute les analyses d’images et les définitions de bases tout en affectant un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Une fois l’analyse primaire terminée, le logiciel MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire, comme décrit cidessous.
Démultiplexage
Le démultiplexage est la première étape dans l’analyse si la feuille d’échantillons répertorie plusieurs échantillons et que l’analyse comporte des lectures d’index. Le démultiplexage sépare les données des échantillons groupés en fonction de séquences d’indexage courtes qui marquent les échantillons provenant de librairies différentes. Chaque séquence de lecture d’index est comparée aux séquences d’indexage définies dans la feuille d’échantillons. Aucune valeur de qualité n’est prise en compte lors de cette étape.
Génération de fichier FASTQ
Après le démultiplexage, MiSeq Reporter génère des fichiers intermédiaires au format FASTQ, un format texte utilisé pour représenter des séquences. Les fichiers FASTQ contiennent les lectures de chaque échantillon et les scores de qualité, à l’exclusion des lectures provenant de tout amplifiat qui n’est pas passé par le filtre. Le score de qualité est calculé de la façon suivante : -10 log
10
P, où P est la probabilité que la définition des bases soit incorrecte.
Alignement
L’alignement compare les séquences par rapport à la référence pour identifier une relation entre les séquences et attribue un score en fonction des régions de similarité. Les lectures alignées sont écrites dans des fichiers au format
BAM. Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise un algorithme de Smith-Waterman par bande, qui effectue des alignements de séquence locaux pour identifier des régions similaires entre deux séquences.
Mars 2015 nº 15070068 Rév. A FRA
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