Instrument MiSeqDx
Extraction d’ADN
Trois différentes méthodes d’extraction, à savoir l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool et la filtration sur colonne de silice, ont été évaluées à l’aide du sang total anticoagulé K
2
EDTA. Quatorze échantillons de sang unique ont été utilisés dans l’étude, représentant une plage de génotypes d’un seul gène représentatif. Les trois méthodes d’extraction de l’ADN ont été testées indépendamment par 2 opérateurs différents qui ont chacun effectué
3 analyses par méthode d'extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents. La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADN génomique extrait ont été déterminés par spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168
(14 échantillons x 2 opérateurs/méthode d’extraction x 3 analyses/opérateur x 2 réplicats/échantillon d’ADN génomique extrait).
Méthode d’extraction
Nombre d’échantillons testés
Débit d'appel
100 % Précipitation dans l’alcool
Filtration sur colonne de silice
Extraction à base de billes magnétiques
168
168
168
100 %
100 %
Précision 1
100 %
100 %
100 %
Débit au premier passage de l’échantillon 2
100 %
100 %
100 %
1
Précision : la concordance en pour cent avec une méthode d'essai de référence (séquençage bidirectionnel de Sanger) calculée pour les positions de base qui reçoivent un appel de base.
2 Débit au premier passage de l’échantillon : le nombre d'échantillons respectant le taux d’appel spécifié la première fois qu’ils sont traités (c’est-à-dire, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une nouvelle analyse ou un traitement supplémentaire) en pourcentage du nombre total d’analyses d’échantillons au cours d’une seule expérience de séquençage MiSeqDx.
Entrée d’ADN
La plage d’entrée d’ADN pour la plateforme MiSeqDx a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série à l’aide de 14 échantillons d'ADN représentatifs contenant 16 variants du gène unique. Chaque échantillon a été testé en double exemplaire à 9 niveaux d'entrée d'ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng,
10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes de l’échantillon ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel par la méthode de Sanger. La limite supérieure de l’entrée d’ADN a été déterminée à
25 ng et la limite inférieure à 1 250 ng pour une entrée d'ADN, puisqu'elles présentaient un débit au premier passage de l'échantillon ≥ 95 sans appels incorrects (précision et débit d'appel de 100 %).
Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont fait l’objet d’autres tests avec 4 échantillons d'ADN représentatifs et
20 réplicats par niveau d'entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 * 20 = 80 échantillons), tandis que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon (n = 14 * 20 = 280 échantillons).
Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision était de 100 % à tous les niveaux d'entrée d'ADN et les taux d’appel de l’échantillon étaient > 99 %.
Substances interférentes
Pour évaluer l’impact des substances interférentes sur la plateforme MiSeqDx, un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases a été évalué en présence et en absence d’interférences potentielles. Huit échantillons de sang total représentant huit génotypes uniques ont été utilisés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes
(bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant dans les échantillons de sang total avant l’extraction d’ADN. Pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été intégré dans des échantillons de sang à deux concentrations. Les limites de concentration pour chaque substance sont indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, afin d’évaluer les interférences résultant de la préparation des
Mars 2015 nº 15070068 Rév. A FRA
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